Die Funktion und Entwicklung eines genetischen Schalters, der die sexuell dimorphe Augendifferenzierung bei Honigbienen steuert

Nature Communications Band 14, Artikelnummer: 463 (2023) Diesen Artikel zitieren

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Tiere entwickeln geschlechtsspezifische morphologische Strukturen, die zwischen den Organismen unterschiedlich sind. Das Verständnis der Entwicklungs- und Evolutionsmechanismen, die diese Merkmale steuern, ist jedoch immer noch begrenzt und weitgehend auf Gene der DM-Domäne beschränkt, bei denen es sich um konservierte, geschlechtsspezifische Entwicklungsregulatoren handelt, die in genetischen Modellen identifiziert wurden. Hier berichten wir über ein geschlechtsspezifisches Entwicklungsregulatorgen, Glubschauge (Glu), das selektiv die sexuell dimorphe Augendifferenzierung bei Honigbienen reguliert. Wir fanden heraus, dass das Geschlechtsbestimmungsgen feminizer (fem) das geschlechtsspezifische Spleißen von Glu-Transkripten steuert und so einen genetischen Schalter etabliert, bei dem Glu-Proteine mit einer Zinkfingerdomäne (ZnF) nur bei Frauen exprimiert werden. Wir haben gezeigt, dass die weibliche Kodierungssequenz für eine teilweise Feminisierung essentiell und ausreichend ist. Vergleichende Sequenz- und Funktionsstudien ergaben, dass auf den evolutionären Ursprung des genetischen Schalters der mutationsbedingte Ursprung der essentiellen ZnF-Domäne folgte. Unsere Ergebnisse zeigen, dass Glu ein neu entwickelter geschlechtsspezifischer genetischer Schalter zur regionalspezifischen Regulierung eines dimorphen Charakters ist.

Morphologische Unterschiede zwischen Männchen und Weibchen kommen in tierischen Organismen sehr häufig vor. Die Entwicklung eines solchen Sexualdimorphismus steigert direkt oder indirekt die Fitness des Trägers. Die übertriebenen Hörner einiger Käfer sowie die Farbmuster und die Größe des Pfauenschwanzes liefern faszinierende Beispiele für solche sexuell dimorphen Strukturen. Die evolutionäre Entstehung neuer Geschlechtsmerkmale in verschiedenen Tierlinien führt zu bemerkenswerten Unterschieden zwischen den Organismen. Unser Wissen über die molekularen Entwicklungs- und Evolutionsmechanismen, die den Sexualdimorphismus steuern, ist jedoch noch begrenzt. Dies liegt zum Teil daran, dass sich die Arbeit auf eine begrenzte Anzahl sexuell dimorpher Merkmale konzentrierte und in sehr wenigen genetischen Modellen systematisch nach Entwicklungsregulatoren gesucht wurde.

Die Geschlechtsbestimmung erzeugt ein binäres Signal, das normalerweise über eine Kaskade von Genen an geschlechtsspezifisch kontrollierte Entwicklungsregulatoren weitergeleitet wird, die für die Vermittlung von Aspekten der sexuellen Differenzierung verantwortlich sind1,2,3. Bei Wirbeltieren bestimmt der Geschlechtsbestimmungsweg das Geschlecht der Gonaden. Die Gonaden produzieren Sexualhormone, die das sexuelle Schicksal der nicht-gonadalen Gewebe regulieren. Bei Wirbellosen wird das primäre Signal zur Geschlechtsbestimmung an Entwicklungsregulatoren weitergeleitet, die Transkriptionsfaktoren sind. Das Ergebnis ist eine rein zellautonome, aber koordinierte Entscheidung über das sexuelle Schicksal. Ein wichtiger Entwicklungsregulator für sexuellen Dimorphismus bei Wirbellosen ist das DM-Domänen-Gen1,2,4. Dieses Gen kodiert einen Transkriptionsfaktor vom DM-Domänentyp mit einer ineinander verschlungenen DNA-Bindungsdomäne vom Zinkfingermotiv-Typ und ist an der Spezifikation von Fortpflanzungsorganen beteiligt1,5. Sexuelle Dimorphismen, die durch Gene der DM-Domäne in anderen Körperteilen reguliert werden, sind die Morphogenese der männlichen Tale bei Caenorhabditis elegans6,7, die männlich-spezifische Antenne und der kopulatorische Brusthaken beim Krebstier Daphnia magna8, Geschlechtskämme an den männlichen Vorderbeinen bei Drosophila melanogaster9,10, sexuell dimorph übertriebene Hornstrukturen bei einigen Käfern11,12,13 und andere Merkmale4,14,15,16,17,18. Ein allgemeines Merkmal, das aus diesen Studien hervorgeht, ist, dass Gene der DM-Domäne Entwicklungsregulatoren sind, die als geschlechtsspezifische genetische Schalter fungieren, da sie eine Aktivität bereitstellen, die entweder auf ein Geschlecht beschränkt ist (Aktivitätszustände EIN oder AUS) oder sich zwischen den Geschlechtern unterscheidet. Systematische Screenings ergaben, dass das Doublesex-Gen (dsx) (das zu den DM-Domänengenen bei Insekten gehört) der wichtigste Entwicklungsregulator der sexuellen Differenzierung bei D. melanogaster ist, da es nahezu alle sexuell dimorphen Merkmale dieser Art spezifiziert19,20. Wie andere sexuell dimorphe Merkmale reguliert werden, ist jedoch weitgehend unbekannt.

Unsere früheren Arbeiten legten nahe, dass neben den Fortpflanzungsorganen auch die äußeren sexuell dimorphen Merkmale der Honigbiene Apis mellifera nicht durch das dsx-Gen spezifiziert werden21. Zu diesen Merkmalen gehören die Facettenaugen, die bei Männchen etwa viermal größer sind als bei Weibchen (siehe Wildtyp-Phänotypen (wt) in der ergänzenden Abbildung 1A), was wahrscheinlich eine Anpassung ist, um Männchen und Königinnen während ihres Paarungsflugs zu erkennen 22, 23, 24. Quantitative Messungen der Augengrößen bei dsx-Funktionsverlustmutanten zeigten, dass das dsx-Gen für die Entwicklung des sexuell dimorphen Auges nicht erforderlich ist (ergänzende Abbildung 1B).

Dieses Wissen motivierte uns, systematisch nach einem weiteren geschlechtsspezifischen Entwicklungsregulator zu suchen. Wir wollten die sexuell dimorphe Funktion testen und den evolutionären Ursprung dieses anderen Regulators untersuchen, mit dem Ziel, den Entwicklungs- und Evolutionsmechanismus, der der Bildung sexuell dimorpher Merkmale zugrunde liegt, tiefgreifend zu verstehen. Wir haben ein Gen identifiziert, das selektiv die sexuell dimorphe Augendifferenzierung spezifiziert, und haben es glubschauge (glu) genannt. Das Gen fungiert als geschlechtsspezifischer genetischer Schalter, da es bei Frauen und Männern unterschiedliche Aktivitäten auslöst. Nur die frauenspezifischen Transkripte kodieren für ein Protein mit einem Zinkfinger (ZnF). Wir haben außerdem gezeigt, dass die frauenspezifische Kodierungssequenz für die teilweise Feminisierung der gesamten Struktur essentiell und ausreichend ist. Vergleichende evolutionäre Sequenz- und Funktionsstudien ergaben, dass das Gen neu für den Weg zur Geschlechtsbestimmung rekrutiert wurde, woraufhin der evolutionäre Gewinn des essentiellen ZnF-Motivs folgte. Unsere Ergebnisse zeigen, dass Glu ein neu entwickelter geschlechtsspezifischer Entwicklungsregulator ist, der den sexuellen Dimorphismus einer einzelnen Struktur, dem Facettenauge, steuert. Zusammengenommen deuten diese Ergebnisse auf eine regionalspezifische Kontrolle hin, bei der sexuell dimorphe Merkmale in verschiedenen Körperteilen durch unterschiedliche geschlechtsspezifische Entwicklungsregulatoren, Glu und DSX, gesteuert werden.

Um einen anderen Regulator der sexuell dimorphen Entwicklung als das dsx-Gen zu identifizieren, haben wir nach geschlechtsspezifisch gespleißten Transkripten gescreent. Bei Honigbienen ist der heterozygote oder homozygote/hemizygote Genotyp des komplementären Geschlechtsbestimmungsgens (csd) das primäre Signal der Geschlechtsbestimmung (Abb. 1a). Das csd-Gen reguliert das weibliche und männliche spezifische Spleißen des feminisierenden (fem) Transkripts und erzeugt nur bei Frauen ein funktionelles Fem-Protein25,26. Das fem-Gen steuert somit die gesamte Entwicklung von Weibchen und Männchen25,26. Das bei Frauen exprimierte Fem-Protein steuert zumindest das frauenspezifische Spleißen der Transkripte des Entwicklungsregulatorgens dsx, das die Gonadenentwicklung spezifiziert (Abb. 1a)21. Die männliche Spleißvariante des Fem-Transkripts wird standardmäßig erstellt25,26. Wir führten eine Sequenzierung des weiblichen und männlichen embryonalen Transkriptoms durch und suchten nach geschlechtsspezifischen Spleißverbindungen, die nur bei Frauen, nicht aber bei Männern vorhanden sind (Abb. 1b). Diese Transkripte werden möglicherweise durch das Fem-Protein reguliert, das ein Ortholog des Transformer-Proteins in Drosophila25,26 ist. Wir fanden heraus, dass die Transkripte des Glubschauge-Gens (glu, Gen-ID 552468) geschlechtsspezifisch gespleißt sind, sodass Proteine mit einem Zinkfinger-Motiv nur bei Frauen exprimiert werden können.

a Ein Modell des Geschlechtsbestimmungswegs mit dem dsx-Gen als geschlechtsspezifischem Entwicklungsregulator der Differenzierung der Fortpflanzungsorgane. Die Proteine sowie das geschlechtsspezifische Spleißen der Transkripte sind schematisch dargestellt. A und B sind Proteinvarianten, die von verschiedenen csd-Allelen abgeleitet sind. Unterschiedliche Farben kennzeichnen Exons und Proteine, die geschlechtsspezifisch gespleißt oder exprimiert werden. csd: komplementäres geschlechtsbestimmendes Gen. fem: feminisierendes Gen. b Die experimentelle Strategie zur Identifizierung anderer Entwicklungsregulatoren, die geschlechtsspezifisch gespleißt sind und durch das fem-Gen reguliert werden. Die Transkriptomanalyse in Embryonen identifizierte geschlechtsspezifisch gespleißte Transkripte. Die Analyse der kodierenden Sequenz identifizierte mögliche DNA-Bindungsdomänen.

Wir haben RNA-seq-Reads und RT-PCR-Amplikonsequenzen von männlichen und weiblichen Embryonen und Erwachsenen auf die Genomsequenz abgebildet und festgestellt, dass das Glu-Gen aus 10 Exons besteht (Abb. 2a). Die Transkripte werden von zwei Transkriptionsstartstellen aus transkribiert (Abb. 2a, b) und alternativ gespleißt, was darauf hindeutet, dass mindestens drei mögliche Translationsstartstellen in den Exons 2, 3 und 4 verwendet werden. Spleißakzeptorstellen in Exon 8 sind geschlechtsspezifisch, was zu einer Verschiebung des offenen Leserahmens von Exon 8 (ORF; Abb. 2c) führt. Somit können die Transkripte weibliche und männliche spezifische Proteinvarianten exprimieren, die gemeinsame N-terminale und geschlechtsspezifische C-terminale Aminosäuresequenzen aufweisen. Die gemeinsame Region ist 210 bis 316 Aminosäuren lang. Der frauenspezifische Teil des Proteins besteht aus 1256 Aminosäuren und enthält ein ZnF-Motiv vom Typ CCHH, das eine mögliche DNA-Bindungsdomäne darstellt28. Die männerspezifische Region ist nur 16 Aminosäuren lang. Wir kommen zu dem Schluss, dass das Glu-Gen Proteine mit einer ZnF-Domäne speziell bei Frauen exprimieren kann, die bei Männern fehlt. In Glu-Proteinen wurden keine anderen konservierten Motive als die ZnF-Domäne vorhergesagt.

a Schema der genomischen Organisation des Glu-Gens. Die roten Pfeile und die Zahlen über der Genomstruktur zeigen die Zielorte der sgRNAs an, die für die CRISPR/Cas9-Mutagenese verwendet werden. b Frauen- und männerspezifische Transkripte und Proteine. Kästchen bezeichnen die Exons. Frauenspezifische Teile des ORF werden in Rot, Männerspezifische Teile in Blau und gemeinsame Teile in Dunkelgrau dargestellt. Die Position des CCHH-Zinkfingermotivs (ZnF) ist gelb angezeigt. c Die Grenze der Exons 7 und 8, die geschlechtsspezifisch gespleißt ist. Die kodierende Nukleotidsequenz der mRNA und die kodierten Aminosäuren werden angezeigt.

Um festzustellen, ob das Glu-Gen durch das Fem-Gen kontrolliert wird, führten wir Stoppcodons in das Fem-Gen ein und untersuchten das sexuelle Spleißen von Glu-Transkripten. Frühe Stoppcodons wurden über Frame-Shift-Mutationen in Exon 3 und beiden Allelen (ergänzende Abbildung 2) unter Verwendung der CRISPR/Cas9-Methode29 und des effizienten somatischen Mutationsansatzes21 eingeführt. Diese fem −/− Mutationen ahmen den männlichen Regulierungszustand nach (Abb. 1a)26. Wir suchten nach mutierten Individuen ohne Mosaikismus21, die wir durch die Tiefensequenzierung der Amplifikate für jedes Individuum identifizierten (Ergänzungstabelle 1). Wir haben bestätigt, dass es sich bei der fem −/−-Mutation um eine Mutation mit Funktionsverlust handelt, indem wir nur das männliche dsx-Transkript bei genetisch bedingten Weibchen nachgewiesen haben (Abb. 3a und Ergänzungstabelle 2). Bei diesen weiblichen −/− Weibchen wurde nur die männliche Glu-Spleißvariante nachgewiesen, während bei Wildtyp-Weibchen nur das weibliche Glu-Transkript gefunden wurde (Abb. 3a). Diese Verschiebung beim Spleißen zeigt, dass das weibliche Spleißen von Glu-Transkripten direkt oder indirekt durch das fem-Gen gesteuert wird.

a Geschlechtsspezifisches Spleißen von Glu-Transkripten als Reaktion auf fem −/− Mutationen. Einzelne weibliche Larven im Stadium 1 wurden analysiert. Oberes Feld: Größenaufgelöste Amplifikate aus den RT-PCRs, die anhand von ef-1α-Transkripten (ef1α, Elongationsfaktor 1α) als Referenz semiquantitativ an einzelne Personen angepasst wurden. Weibliche (gluF) und männlich spezifische (gluM) Glu-Fragmente wurden mit einem einzigen Primerpaar amplifiziert. Tabelle: Anzahl der Personen, bei denen gluF untersucht wurde. gluM-Transkripte zeigten eine geringe Häufigkeit und wurden in den Mutanten inkonsistent amplifiziert. gluDNA: DNA. b Das Glu-Spleißen in weiblichen dsx-Stop/Stop-Mutanten und das dsx-Spleißen in weiblichen Glu-∆ex2-8/∆ex2-8-Mutanten. Die Antennen von 4 bis 5 Puppen oder Erwachsenen wurden gepoolt und analysiert. wt: Wildtyp-Steuerelemente. C: Negativkontrolle für PCR.

Um besser zu verstehen, ob Glu und dsx parallel operierende Gene sind, die unter der Kontrolle des fem-Gens stehen, haben wir das Glu-Spleißen in dsx-Funktionsverlustmutanten und das dsx-Spleißen in glu-Funktionsverlustmutanten untersucht. Auch hier wurden biallelische Mutationen für das dsx-Gen bei Frauen (dsx stop/stop)21 und das glu-Gen (glu ∆ex2-8/∆ex2-8; sgRNAs 1 und 3) mithilfe der CRSPR/Cas9-Methode erzeugt. Wir haben beobachtet, dass der Mangel an dsx-Aktivität keinen Einfluss auf das Glu-Spleißen hat (Abb. 3b). Darüber hinaus hat die fehlende Glu-Aktivität keinen Einfluss auf das DSX-Spleißen (Abb. 3b). Diese Ergebnisse zeigten, dass das Spleißen von Glu-Transkripten nicht von der dsx-Aktivität abhängt und dass das Spleißen von dsx-Transkripten keine Glu-Aktivität erfordert. Wir kommen zu dem Schluss, dass dsx und glu zwei geschlechtsspezifische kontrollierte Gene sind, die in parallelen Zweigen des geschlechtsbestimmenden Signalwegs unter der Kontrolle des fem-Gens arbeiten.

Um festzustellen, ob das männliche Transkript der standardmäßige regulatorische Zustand ist, der nicht auf Eingaben des fem-Gens beruht, untersuchten wir das Glu-Spleißen in verschiedenen embryonalen Stadien vor und nach dem Einsetzen des Geschlechtsbestimmungswegs26,30. In 0 bis 15 Stunden alten Embryonen konnten wir nur eine Variante nachweisen, die in späteren Stadien männlich-spezifisch ist (Abb. 4a). Ab 25 Stunden, mit dem Einsetzen des Geschlechtsbestimmungswegs und dem alternativen Spleißen von Fem-Transkripten nach 24–39 Stunden im zellulären Blastodermstadium26,30, zeigte das Glu-Gen frauenspezifisches Spleißen. Das männlich-spezifische Transkript ist der standardmäßige regulatorische Zustand, der über Fem-Protein-vermitteltes Spleißen in den weiblich-bestimmten Zustand wechselt. Insgesamt belegen diese Ergebnisse, dass das Glu-Gen über geschlechtsspezifisches Spleißen von Transkripten als genetischer Schalter mit zwei Aktivitätszuständen fungiert. Diese Transkripte können bei Frauen und Männern unterschiedliche Proteinaktivitäten ausdrücken.

a Geschlechtsspezifische Glu-Transkripte in verschiedenen embryonalen Stadien: Zellularisierung und Beginn des Blastoderms (0–15 Stunden nach der Eiablage), Ende des Blastoderm- und Gastrulationsstadiums (25–40 Stunden) und Larvenvervollständigung (55–70 Stunden)69. Eine semiquantitative RT-PCR wurde an Embryonenpools durchgeführt. b Gewebespezifische Expression von gluF bei Männern und Frauen im Puppenstadium 4 und bei 10 Tage alten männlichen und weiblichen Erwachsenen. Semiquantitative RT-PCR-Ergebnisse wurden probenübergreifend angepasst, wobei die ef1α-Transkriptwerte als Referenz verwendet wurden. Die Bauchprobe enthält keine Gonaden und Ganglien. Es wurden drei biologische Replikate durchgeführt. gluM-Transkripte in Puppen und Erwachsenen wurden nicht amplifiziert (ergänzende Abbildung 4). F: weiblich; M: männlich; ef1α: Dehnungsfaktor 1α; C: Negativkontrolle für PCR.

Als nächstes untersuchten wir, ob das Glu-Gen gewebespezifisch transkribiert wurde, was auf eine regionsspezifische Expression des Glu-Gens hindeutet, die durch die Entwicklungsprogrammierung der allgemeinen Körpermuster gesteuert wird. Im Stadium der roten Augenpuppe (Stadium 4) konnten wir bei allen drei Replikaten (Abb. 4b) zuverlässig gluF-Transkripte (weiblich) im Gehirn (einschließlich des Gewebes der komplexen Augen), den Gonaden und den Hinterbeinen nachweisen (Abb. 4b), in den anderen jedoch nicht untersuchte Gewebe. Bei erwachsenen Honigbienenweibchen fanden wir, dass gluF im Gehirn, im Bauch, in der Antenne und in den Hinterbeinen exprimiert wurde (Abb. 4b). Wir haben nie eine gluF-Expression im Brustkorb oder in der Kopfkapsel erwachsener Bienen festgestellt. Interessanterweise konnten wir die männliche Variante bei Puppen und Erwachsenen nie zuverlässig amplifizieren (ergänzende Abbildung 3), was auf das Fehlen männlicher Transkripte schließen lässt. Wir kommen zu dem Schluss, dass das männerspezifische Transkript einen inaktiven Zustand des genetischen Schalters darstellt. Da die männlichen Fem-Transkripte auch in Puppen fehlen26, ist es möglich, dass die frühen Stoppcodons einen durch Unsinn vermittelten Zerfall der männlich-spezifischen gluM- und femM-Transkripte auslösen31. Insgesamt zeigen diese Ergebnisse, dass das Glu-Gen ein regionaler und geschlechtsspezifischer genetischer Schalter ist, der eine auf nur ein Geschlecht beschränkte Aktivität und dies in bestimmten Geweben ermöglichen kann.

Um zu verstehen, ob das geschlechtsspezifisch gespleißte Glu-Gen ein Entwicklungsregulator des Sexualdimorphismus ist, haben wir Glu in weiblichen Embryonen mit der CRISPR/Cas9-Methode mutiert, Larven mit Arbeiterernährung bis zum Puppenstadium aufgezogen und auf Nicht-Mosaik-Individuen gescreent, in denen beides vorkommt Allele wurden durch Tiefensequenzierung von Amplifikaten mutiert21,29. Genetische Weibchen, die homozygot für Exon 2- bis Exon 8-Deletionen waren (glu ∆ex2-8/∆ex2-8, sgRNA1 und 3), entwickelten größere Augen mit einer männlichen dorsalen Verlängerung (Pfeilspitzen, Abb. 5a). Ihre relative Länge und Breite ihrer Facettenaugen war signifikant größer, während der relative Augenabstand ihrer Facettenaugen im Vergleich zu Wildtyp-Weibchen signifikant kürzer war (Abb. 5c). Diese Ergebnisse deuten auf einen teilweisen Verlust weiblicher Merkmale und einen teilweisen Gewinn männlicher Merkmale hin. Andere sexuell dimorphe Merkmale der äußeren Körpermorphologie und der Fortpflanzungsorgane (bis zur Stereomikroskop-Detektion) waren die gleichen wie bei den Wildtyp-Weibchen (ergänzende Abbildung 4), was darauf hindeutet, dass die grobe Entwicklungsfunktion von gluF auf die Region beschränkt ist Facettenauge. Um zu verstehen, ob das Glu-Gen frauenspezifische und nicht allgemeine Entwicklungsmerkmale reguliert, haben wir speziell den auf Frauen beschränkten Teil des Proteins kompromittiert. Wir haben Stoppcodons in Exon 8 mithilfe von sgRNA 10 eingeführt, sodass das frauenspezifische CCHH-ZnF-Motiv zusammen mit den letzten 254 bis 291 Aminosäuren nicht exprimiert wurde. Die glu ex8stop/ex8stop-Weibchen zeigten den gleichen Phänotyp wie die glu ∆ex2-8/∆ex2-8-Weibchen (sie unterschieden sich nicht signifikant), während wir erneut die Auswirkungen auf die relative Augenbreite, -länge und den Augenabstand fanden (Abb. 5a– C). Dieses Ergebnis zeigt, dass gluF-Transkripte einen Entwicklungsregulator der sexuell dimorphen Augenentwicklung kodieren. Als nächstes wollten wir untersuchen, ob das gluM-Transkript für männliche Merkmale erforderlich ist, trotz der fehlenden Expression bei männlichen Puppen und Erwachsenen. Wir konnten diese Hypothese jedoch nicht testen, da bereits die Aufzucht der Puppenkontrollmännchen fehlschlug (trotz einer ähnlichen Anzahl von Eiern), was darauf hindeutet, dass unser Aufzuchtverfahren nicht einfach auf Männchen angewendet werden kann.

a Kopfmorphologie der weiblichen glu ∆ex2-8/∆ex2-8 (n = 10) und glu ex8stop/ex8stop (n = 5) Mutanten im Puppenstadium 4 (Rote-Augen-Stadium). Pfeilspitzen markieren die männliche dorsale Verlängerung des Facettenauges. b Die eingeführten DNA-Mutationen und die erwarteten Proteinprodukte werden schematisch dargestellt. c Relative Augenbreite: Augenbreite im Verhältnis zur Kopfbreite. Relative Augenlänge: Augenlänge im Verhältnis zur Kopflänge. Relativer Augenabstand: Augenabstand im Verhältnis zur Kopfbreite (zweiseitiger Mann-Whitney-U-Test). Mittelwerte und Standardabweichungen werden angezeigt. d Schematische Darstellung der Erzeugung der glu ex7-8 F-Mutation bei Männern. e Kopfmorphologie feminisierter glu ex7-8 F-Männchen (n = 9) im Erwachsenenstadium. Die Pfeilspitze markiert eine Verringerung des Rückenschlusses bei mutierten Männchen. f Dorsaler Linsenfacettendurchmesser, zweiseitiger Mann-Whitney-U-Test. Mittelwerte und Standardabweichungen werden angezeigt. Gewicht: Wildtyp.

Nachdem wir gezeigt hatten, dass die frauenspezifische Kodierungssequenz essentiell ist, fragten wir als nächstes, ob sie ausreicht, um die gesamte Struktur des Facettenauges zu feminisieren. Wir haben die Intron-7-Sequenz gelöscht und die Exon-7/8-Sequenzen mithilfe der CRISPR/Cas9-vermittelten homologiegesteuerten Reparatur fusioniert, sodass die in Männern vorhandenen Glu-Transkripte nur für frauenspezifische Glu-Proteine kodierten (Abb. 5d, sgRNAs 3 und 7). Die Augen dieser glu ex7-8 F (haploiden) Männchen waren in der Frontalansicht kleiner (Abb. 5e), während der dorsale Augenschluss weniger ausgeprägt war (Pfeilspitzen, Abb. 5e), was auf eine teilweise Abweichung vom Männchen hinweist zur weiblichen Augenmorphologie, die sich auf die gesamte Augenstruktur auswirkt. Als nächstes fragten wir, ob die hinteren Linsenfacetten der Facettenaugen feminisiert seien. Die Größen der dorsalen Linsenfacetten bei Honigbienen sind extrem sexuell dimorph und tragen zum gesamten geschlechtsspezifischen Größenunterschied des Facettenauges bei23,24. Die größeren Männchenfacetten weisen eine höhere Lichtempfindlichkeit auf und stellen eine Anpassung dar, um Drohnen und Königinnen während des Paarungsflugs des Männchens zu erkennen. Wir fanden heraus, dass die dorsalen Linsenfacetten der glu ex7-8 F-Männchen im Wesentlichen feminisiert waren (p < 0,001, Abb. 5f) und im Vergleich zu Wildtyp-Weibchen nahezu eine vollständige Größenverschiebung aufwiesen. Diese Ergebnisse legen nahe, dass die glu ex7-8 F-Kodierungssequenz ausreicht, um eine Feminisierung der Augenmorphologie herbeizuführen. Die beobachtete Feminisierung war jedoch teilweise, was darauf hindeutet, dass mindestens ein weiteres Gen auch an der sexuell dimorphen Augendifferenzierung beteiligt ist.

Die wichtigsten Regulatoren, die Entwicklungsmerkmale beeinflussen, sind häufig Transkriptionsfaktoren (TFs), die mehrere nachgeschaltete Gene und terminale Zellmerkmale regulieren. TFs zeichnen sich durch DNA-Bindungsdomänen wie CCHH-Zinkfingerdomänen aus28,32,33. Um zu untersuchen, ob das frauenspezifische CCHH-ZnF-Motiv von Glu ein Schlüsselelement einer möglichen TF ist, haben wir wesentliche Positionen dieses Motivs verändert 34, 35, 36 und seine Rolle bei der sexuell dimorphen Augenentwicklung untersucht. Bisher war es schwierig, solche Motivfunktionen in nichtgenetischen Modellen zu ermitteln. Hier verwendeten wir eine CRISPR/Cas9-vermittelte homologiegesteuerte Reparatur, um die Nukleotide, die für Cystein und Histidin des Kern-ZnF-Motivs kodieren, durch solche zu ersetzen, die für Alanin kodieren (Abb. 6a), mit dem Ziel, eine mögliche ZnF-Struktur bei Frauen zu zerstören37,38,39 . Die homozygoten Doppelmutanten (glu tmC2H2/tmC2H2) zeigten eine signifikant größere relative Augenlänge (p < 0,05), einen etwas kürzeren Augenabstand (p = 0,06) und die gleiche Augenbreite wie die Kontrollen (Abb. 6b, c), was auf a schließen lässt Funktion dieses Motivs in der sexuell dimorphen Entwicklung. Darüber hinaus zeigten die heterozygoten glu tmC2H2/ex8stop-Weibchen (wobei ein Allel ein Allel mit Funktionsverlust war) einen größeren teilweisen Verlust weiblicher Merkmale, was einen intermediären Phänotyp zwischen den homozygoten glu tmC2H2/tmC2H2 und glu ∆ex2-8/∆ex2-8 darstellt Mutanten (Abb. 6b, c). Diese Ergebnisse belegen eine Rolle des CCHH-Motivs bei der sexuell dimorphen Augenentwicklung und stützen die Annahme, dass das Glu-Gen einen frauenspezifischen Transkriptionsfaktor kodiert. Die Augenweite wurde jedoch durch die CCHH-Mutation nicht beeinflusst. Da Entwicklungsregulatoren vom ZnF-Typ normalerweise mehr als eine ZnF-Domäne haben, fragten wir als nächstes, ob weibliche Glu-Proteine andere ZnF-Motive enthalten. Wir haben drei weitere mögliche ZnF-Motive des nicht-kanonischen Typs gefunden, die sich um das CCHH-ZnF-Motiv befinden (ergänzende Abbildung 5), was auf die Möglichkeit zusätzlicher DNA-Bindungsdomänen hinweist.

ein Schema der tmC2H2-Mutationen, die über CRISPR/Cas9-vermittelte homologiegesteuerte Reparatur induziert wurden. Das CCHH-ZnF-Kernmotiv C-X2−4-C-X12-H-X3−5-H34,35,36 wird zusammen mit den entsprechenden Nukleotid- und Aminosäuresequenzen des Wildtyps (wt) und des tmC2H2-Allels gezeigt. Rote Buchstaben kennzeichnen Codons und Aminosäuren des Kern-CCHH-Motivs. Stille Mutationen verhindern die weitere Bindung von sgRNAs an ihre Zielstellen. Unterstrichene Sequenz: Ziele von sgRNA 10 und 9. C: Cystein, H: Histidin, A: Alanin. b Augenmorphologie von glu tmC2H2/tmC2H2 (n = 10) und glu tmC2H2/ex8stop (n = 6) mutierten Weibchen im Puppenstadium 4. Die Aminosäuren um die ZnF-Kodierungssequenzen sind dargestellt. Das Zinkfingermodul (ZnF) ist gelb hervorgehoben, während die induzierten Aminosäureänderungen des Kernmotivs rot dargestellt sind. c Relative Größen und Positionen der Augen in den Mutanten (einseitiger Mann-Whitney-U-Test). Mittelwerte und Standardabweichungen werden angezeigt.

Da die Funktion von Glu als geschlechtsspezifischer Entwicklungsregulator der sexuell dimorphen Differenzierung bei anderen Arten nicht beschrieben wurde, haben wir untersucht, ob sich diese Funktion neu entwickelt hat. Um einen Einblick in die Evolutionsgeschichte dieses Gens zu erhalten, untersuchten wir zunächst die geschlechtsspezifische Expression von Glu-Homologen in Arten, die aus wichtigen Insektenlinien stammen (ergänzende Abbildung 6). Beim Dipteren-Insekt D. melanogaster, dem Käfer Tribolium castaneum und dem Hemipteren-Insekt Cimex lectularius (Bettwanze) wurden Glu-Homologe nicht geschlechtsspezifisch gespleißt oder transkribiert (Abb. 7a). Bei der Hymenopteren-Juwelwespe Nasonia vitripennis wurden die Transkripte des Glu-Homologs (Nv-glu) jedoch geschlechtsspezifisch mit einem frauenspezifischen Transkript und einem für Frauen und Männer gemeinsamen Transkript gespleißt (Abb. 7a und ergänzende Abb. 6). . Als nächstes untersuchten wir, ob dieses geschlechtsspezifische Spleißen bei der Juwelenwespe durch das Tra-Gen (das Ortholog des Fem-Gens der Honigbiene) gesteuert wurde. Der Abbau des tra-Gens bei N. vitripennis-Weibchen mittels systemischer RNAi führte zu einer Verringerung des frauenspezifischen Nv-glu-Transkripts und einem starken Anstieg des gemeinsamen Transkripts im Vergleich zu mit gfp-dsRNA behandelten Kontrollen (Abb. 7b). Dieses Ergebnis legt nahe, dass das Tra-Gen (entweder direkt oder indirekt) das frauenspezifische Spleißen des Glu-Orthologen in N. vitripennis steuert. Aus der größtmöglichen Sparsamkeit dieser Ergebnisse schließen wir, dass das geschlechtsspezifische Spleißen von Glu durch Fem/Tra in der Abstammungslinie der Hymenopteren-Insekten evolutionär entstanden ist.

Eine geschlechtsspezifische Spleißkontrolle entwickelte sich in der Hymenopteren-Linie. Spleißen von Glu-Orthologen in D. melanogaster (CG12316), C. lectularius (LOC106661925), T. castaneum (LOC103312333) und N. vitripennis (Nv-glu). Es wurden die zum Exon 7/8 der Honigbiene homologen Sequenzen untersucht. Semiquantitative RT-PCR-Ergebnisse wurden über drei biologische Replikate unter Verwendung von ef1α-Transkripten (Elongationsfaktor 1α) von C. lectularius (Cl-ef1α) und T. castaneum (Tc-ef1α) sowie dem ribosomalen Protein L38 von D. melanogaster (RPL38) angepasst. Nv-gluF von N. vitripennis ist frauenspezifisch gespleißt und kodiert für ein frauenspezifisches Peptid, während Nv-gluC beiden Geschlechtern gemeinsam ist. Nv-gluDNA ist die amplifizierte Genomsequenz. b Das geschlechtsspezifische Spleißen von Nv-glu in N. vitripennis wird durch das tra-Gen gesteuert. Der Abbau des Tra-Gens wurde durch systemische RNAi vermittelt. dsRNA: doppelsträngige RNA. Gfp: Kontroll-dsRNA. Die RT-PCR-Ergebnisse wurden semiquantitativ an drei Pools angepasst, die 3, 4 und 5 Tage (d) nach der Behandlung mit Nv-ef1α-Transkripten gesammelt wurden. C: Negativkontrolle für PCR. c Das frauenspezifische CCHH-ZnF-Motiv hat seinen Ursprung evolutionär in Hymenopteren-Insekten. Aminosäuresequenz-Alignment von Glu-Homologen und phylogenetischen Beziehungen der entsprechenden Arten. Repräsentative Beispiele aus wichtigen Evolutionslinien und 49 Hymenopterensequenzen sind in der ergänzenden Abbildung 7 dargestellt. Die phylogenetischen Beziehungen und evolutionären Divergenzzeiten folgen Peters et al.70. Rote Kästchen: Aminosäuren des Kernmotivs; graue Kästchen: hydrophober Kernrückstand; %-Werte neben den Knoten: abgeleitete Wahrscheinlichkeit von Änderungen gemäß der Parsimony-Methode. d Das Glu-Homolog von N. vitripennis ist nicht an der geschlechtsspezifischen Augendifferenzierung beteiligt. Geschlechtsspezifische Augendifferenzierung von N. vitripennis-Männchen und -Weibchen als Reaktion auf den Nv-glu-Gen-Knockdown über systemische RNAi. Es werden absolute und nicht relative Augenparameter dargestellt, da allein die Larveninjektionen und die dsRNA-Behandlung die allgemeine Größe des erwachsenen Kopfes beeinflussten (ergänzende Abbildung 9). Zum Vergleich werden die absoluten und signifikanten Werte der Honigbienen angegeben (ergänzende Abbildung 10). Mittelwerte und Standardabweichungen werden angezeigt.

Unsere Mutationsstudien ergaben, dass das frauenspezifische CCHH-ZnF-Motiv ein Schlüsselelement der sexuell dimorphen Differenzierung des Facettenauges bei Honigbienen ist. Um festzustellen, ob das CCHH-ZnF-Motiv de novo durch Aminosäureaustausch entstanden ist (es fehlt beispielsweise in D. melanogaster), haben wir mithilfe der Methode der maximalen Sparsamkeit aus einem Satz von Glu die Wahrscheinlichkeit unterschiedlicher Vorfahrenzustände der Aminosäuren abgeleitet Homologe Sequenzen aus 49 Hautflüglerarten. Die identifizierten Ahnenzustände legen nahe, dass das CCHH-ZnF-Motiv aus der Aculeata-Linie stammt, nachdem es sich von der Parasitoiden-Wespen-Linie abgespalten hat, zu der auch die Juwelenwespe N. vitripennis gehört (Abb. 7c und ergänzende Abb. 7). Wir fanden heraus, dass sich das CCHH-ZnF-Motiv über eine Reihe von Veränderungen entwickelte, die aus den Vorfahrenzuständen und der Phylogenie der 49 Sequenzen rekonstruiert werden konnten (Abb. 7c und ergänzende Abb. 7). Die Abfolge der evolutionären Veränderungen war wie folgt: (i) Gewinn des erforderlichen Abstands zwischen dem 2. Cystein und dem 2. Histidin durch Insertionen/Deletionen; (ii) Gewinn der hydrophoben Aminosäure Isoleucin (I), einem Kernrest des kanonischen Motivs, durch Punktmutation28,36; und (iii) Gewinn der Aminosäure Histidin (H), die das CCHH-ZnF-Motiv vervollständigte. Diese Ergebnisse legen nahe, dass sich das CCHH-ZnF-Motiv de novo über eine Reihe von Mutationen in der kodierenden Sequenz entwickelt hat.

Das Glu-Homolog in D. melanogaster (CG12316) ist nicht geschlechtsspezifisch gespleißt und weist keinen annotierten Phänotyp auf40,41,42, was die Frage aufwirft, ob sich die Funktion von Glu als geschlechtsspezifischer Entwicklungsregulator neu entwickelt hat. Um Beweise für den evolutionären Ursprung dieser Funktion zu erhalten, untersuchten wir die Rolle von Nv-glu in N. vitripennis mithilfe systemischer RNAi (ergänzende Abbildung 8). Diese Studie an N. vitripennis war in dieser Hinsicht aufschlussreich, da Nv-glu möglicherweise einen möglichen Zwischenzustand der Vergangenheit darstellt, in dem geschlechtsspezifisches Spleißen erreicht wurde, während ein CCHH-ZnF-Motiv noch fehlte. Darüber hinaus wurde zuvor gezeigt, dass der Augenabstand von Männern und Frauen bei N. vitripennis sexuell dimorph ist18. Die Breite, Länge und intraokularen Abstände der Facettenaugen unterschieden sich weder bei Frauen noch bei Männern zwischen Nv-glu-Knockdown- und Kontrollpersonen (Abb. 7d). Diese Ergebnisse aus systemischen RNAi-Experimenten legen nahe, dass das Nv-glu-Gen die sexuell dimorphe Augendifferenzierung bei der Schmuckwespe nicht kontrolliert. Insgesamt führten uns diese Vergleichsergebnisse zu dem Schluss, dass sich die Rolle von Glu als Regulator der sexuell dimorphen Augenentwicklung erst kürzlich bei Hymenopteren-Insekten entwickelt hat, und zwar in der Abstammungslinie, die zu Honigbienen führt.

Ein zentrales Interesse von Entwicklungsbiologen besteht darin, zu verstehen, wie Signale zur Geschlechtsbestimmung in das allgemeine Entwicklungsprogramm integriert sind. Dies ist ein besonders interessantes Thema, da die Unterschiede zwischen den Geschlechtern vielfältig sein können und die sexuellen Dimorphismen bei den Organismen erstaunlich vielfältig sind, was auf eine schnelle Divergenz hindeutet. Wir haben nun mit dem Glu-Gen einen weiteren Regulator der sexuellen Entwicklung charakterisiert und seinen molekularen Kontrollmechanismus aufgeklärt, was zu einem weiteren Verständnis der Bildung sexuell dimorpher Strukturen führt.

Wir haben gezeigt, dass die sexuell dimorphe Augendifferenzierung bei Honigbienen teilweise durch das Glu-Gen reguliert wird, einen geschlechtsspezifischen Entwicklungsregulator, über den bisher nicht berichtet wurde. Das Glu-Gen fungiert als geschlechtsspezifischer genetischer Schalter (Abb. 8a). Die geschlechtsspezifische Aktivität wird durch das weibliche und männliche spezifische Transkriptspleißen bereitgestellt, das durch das fem-Gen, ein Ortholog des tra-Gens, gesteuert wird25,26. Die Fem-Proteine, die auf Frauen beschränkt sind, steuern die Verwendung einer alternativen Spleißakzeptorstelle in Exon 8. Diese frauenspezifischen Transkripte kodieren GluF-Proteine (1466 bis 1572 Aminosäuren) mit ZnF-Domänen. In Abwesenheit von Fem-Proteinen bei Männern wird eine andere Spleißakzeptorstelle in Exon 8 verwendet, die ein frühes Stoppcodon in Glu-Transkripten erzeugt. Das vorhergesagte männliche Protein ohne ZnF-Domäne ist 226–332 Aminosäuren lang. Das Fehlen von Glu-Transkripten bei männlichen Puppen und Erwachsenen lässt jedoch darauf schließen, dass das männliche gespleißte Transkript keine Funktion hat. Möglicherweise ist dieser Mangel an Transkript auf das frühe Stoppcodon zurückzuführen, das einen durch Unsinn vermittelten Zerfall des Transkripts auslösen kann31. Unseren Funktionsstudien zufolge besteht die offensichtlichste Regulation dieses genetischen Schalters darin, dass die Expression des frauenspezifischen ZnF-Domänen-enthaltenden Proteins (GluF) ausschließlich bei Frauen für Aktivität sorgt. Die männlichen Transkripte produzieren entweder ein nicht-funktionelles Protein oder kein Protein.

a Die regionalspezifischen Rollen der glu- und dsx-Gene bei der sexuell dimorphen Differenzierung weiblicher Honigbienen. b Die Abfolge der Evolutionsschritte, die zu einem genetischen Schalter für die sexuell dimorphe Differenzierung führen. Kästchen bezeichnen die Exons. Frauenspezifische Teile des ORF werden in Rot, Männerspezifische Teile in Blau und gemeinsame Teile in Dunkelgrau dargestellt. Das Zinkfingermotiv (ZnF) ist gelb dargestellt.

Das GluF-Protein ist wahrscheinlich ein Transkriptionsfaktor vom ZnF-Domänentyp, der eine Feminisierung der Augenmorphologie reguliert (Abb. 8a). Die männerspezifische Differenzierung resultiert aus dem regulatorischen Standardzustand dieses genetischen Schalters. Unsere Studien zeigten einen intersexuellen Phänotyp mit unterschiedlichem Ausmaß, was darauf hindeutet, dass gluF nur teilweise für die Regulierung der gesamten sexuellen Augenstruktur und hauptsächlich für die sexuell dimorphe Linsenfacettengröße verantwortlich ist. Dies legt nahe, dass andere geschlechtsspezifisch regulierte Gene an der Gestaltung der sexuell dimorphen Augendifferenzierung beteiligt sein müssen. Dabei kann es sich um andere sexuell regulierte Entwicklungsgene und/oder Gene mit allgemeiner Funktion wie der Zellproliferation handeln, die sich auf die Augengröße und -form auswirken können. Bei Drosophila wurde eine geschlechtsspezifische Proliferation von Stammzellen nachgewiesen, die für eine größere Größe des weiblichen Mitteldarmorgans verantwortlich ist43.

Frühere Studien haben gezeigt, dass Gene der DM-Domäne zentrale, konservierte Regulatoren der geschlechtsspezifischen Entwicklung sind. DM-Domänen-Genhomologe in verschiedenen Tierstämmen bestimmen die äußere Geschlechtsmorphologie, wie etwa die Schwanzmorphologie von C. elegans6,7, die männlich-spezifische Antenne und den kopulatorischen Brusthaken des Krebstieres D. magna8, die Geschlechtskämme von D. melanogaster9,10 und die übertriebenen Hornstrukturen einiger Käfer11,12,13. Die Gene der DM-Domäne fungieren dabei als geschlechtsspezifischer genetischer Schalter, der bei Männern und Frauen unterschiedliche Aktivitäten hervorruft. Bei Insekten werden geschlechtsspezifische Aktivitäten durch Spleißen etabliert. Durch fem/tra-homologe Gene vermitteltes Spleißen führt bei vielen Insekten zur Expression geschlechtsspezifischer Dsx-Proteine mit einer gemeinsamen DM-Domäne, aber unterschiedlichen C-Termini3,44,45.

Zwei zentrale Fragen waren (i) wie DM-Domänengene geschlechtsspezifische Strukturen in verschiedenen Körperteilen steuern können und (ii) wie weitgehend konservierte DM-Gene die Bildung neu entwickelter sexuell dimorpher Strukturen steuern können, die zuvor in einer Tierlinie fehlten. Es wurden zwei Mechanismen vorgeschlagen, die hauptsächlich aus Arbeiten resultierten, die sich auf das dsx-Gen bei Insekten und der Gattung Drosophila konzentrierten2,10,12,46,47,48,49,50. Ein Mechanismus, der die sexuell dimorphen Strukturen in verschiedenen Körperteilen erklärt, legt nahe, dass die lokale Expression des dsx-Gens die regionalspezifische sexuelle Anleitung liefert. Beispielsweise sind die männlichen Geschlechtskämme auf das Vorderbein von Drosophila beschränkt und werden durch lokale dsx-Expression in diesem Gewebe induziert9,10. Ein Mechanismus, der den evolutionären Ursprung eines neuen sexuellen Dimorphismus erklärt, legt nahe, dass evolutionäre Fortschritte und Modifikationen der cis-regulatorischen Elemente von dsx-Zielgenen veränderte Genregulationen für neue Merkmale bewirken46,51. Beispielsweise kann sich die Ausweitung der Pigmentierung des Bauchkörpers bei D. melanogaster-Männchen aus evolutionären Fortschritten und Modifikationen dieser cis-regulatorischen Elemente ergeben46,51.

Die Ergebnisse unserer Studie zu Glu deuten nun auf andere Mechanismen hin, die der lokalen Bildung und dem evolutionären Ursprung eines geschlechtsspezifischen Dimorphismus zugrunde liegen. Wir haben gezeigt, dass Glu bei Honigbienen ein neu entwickelter geschlechtsspezifischer Entwicklungsregulator ist, der gewebespezifisch exprimiert wird und die Feminisierung der Augen selektiv reguliert (Abb. 8). Bei Honigbienen reguliert dsx die Entwicklung der sexuellen Fortpflanzungsorgane 21 und nicht die sexuelle Differenzierung des Kopfes oder Auges (ergänzende Abbildung 1). Diese Ergebnisse legen einen Mechanismus nahe, bei dem der sexuelle Dimorphismus in bestimmten Körperteilen durch verschiedene geschlechtsspezifische Entwicklungsregulatoren (glu und dsx) reguliert wird. Sie wirken parallel, jedoch über gewebespezifische Expression in unterschiedlichen Körperregionen (Abb. 8a). Darüber hinaus lieferte die Entwicklung der Glu-Funktion auch Einblicke in die Evolutionsmechanismen, die einem möglichen Ursprung einer sexuell dimorphen Struktur zugrunde liegen. Wir haben gezeigt, dass der evolutionäre Ursprung des geschlechtsspezifischen Ausdrucks (über den Gewinn geschlechtsspezifischen Spleißens) plus der Gewinn der molekularen Funktion (über den Ursprung eines ZnF-Motivs) zu einem neuen geschlechtsspezifischen Entwicklungsregulator für sexuellen Dimorphismus führte.

Der Ursprung sexuell dimorpher Merkmale bleibt ein zentrales Thema der Evolutionsbiologie. Es bleibt die Frage, wie eine solche neue geschlechtsspezifische Regulierung dimorpher Strukturen entstehen könnte. Vergleichende Funktions- und Sequenzstudien des Glu-Gens legen nahe, dass diese Funktion aus einer Sequenz und zwei Schritten entstand (Abb. 8b). Im ersten Schritt wurde Glu für den Weg zur Geschlechtsbestimmung rekrutiert, der den geschlechtsspezifischen genetischen Schalter und die geschlechtsspezifische Expression etablierte. Wir haben diesen Gewinn an geschlechtsspezifischer Kontrolle durch die Entstehung der femabhängigen Spleißkontrolle über Glu-Transkripte nachgewiesen, die möglicherweise nach der Abspaltung der Hymenopteren-Linie von anderen wichtigen Insektenlinien erfolgte. Im zweiten und folgenden Schritt erlangte das Glu-Gen seine geschlechtsspezifische Augendifferenzierungsfunktion innerhalb der Hymenopteren-Insekten und dies in der Abstammungslinie, die zur Honigbiene führte (Abb. 8b). Es wurde zuvor gezeigt, dass dsx für die männliche Kopfstruktur und Augengröße bei der Gattung Nasonia18 verantwortlich ist, während wir gezeigt haben, dass glu keinen Einfluss auf die Augengröße bei N. vitripennis hat. Darüber hinaus haben wir durch die Untersuchung der Entwicklung und Funktion des ZnF-Motivs gezeigt, dass sich die Rolle dieser Domäne für die geschlechtsspezifische Augendifferenzierung nach der Erlangung des geschlechtsspezifischen Ausdrucks neu entwickelte.

Die Abfolge dieser Veränderungen gibt Aufschluss darüber, wie im Laufe der Evolution neuartige sexuell dimorphe Strukturen entstehen können. Wir beobachteten eine Abfolge evolutionärer Veränderungen – Gewinn an geschlechtsspezifischem Ausdruck, gefolgt von der Entstehung einer geschlechtsspezifischen Entwicklungsfunktion –, die seit langem theoretisch vorhergesagt, aber unseres Wissens nach nicht nachgewiesen werden konnte52,53,54. Wir fanden heraus, dass der evolutionäre Gewinn der geschlechtsspezifischen Glu-Expression der erste Schritt war, der einige Mutationen auf die kodierende Sequenz des weiblichen Proteins beschränkte. Wir haben außerdem gezeigt, dass diese Mutationen in der weiblichen Kodierungssequenz an der Bildung eines neuen ZnF-Motivs beteiligt sind, das eine auf Frauen beschränkte Entwicklungsfunktion hat. Somit zeigen unsere Ergebnisse, dass der Gewinn geschlechtsspezifischer Expression ein molekularer Weg ist, durch den neue Entwicklungsregulatoren für sexuellen Dimorphismus evolutionär entstehen können.

Die in dieser Studie verwendeten Honigbienen stammten aus wilden Apis mellifera carnica-Kolonien. Weibliche Embryonen (die diploid sind) wurden aus Eiern gewonnen, die von natürlich begatteten Königinnen gelegt wurden. Haploide männliche Eier wurden von nicht begatteten Königinnen gesammelt, die mit CO2 behandelt wurden, was die Ablage unbefruchteter Eier induziert. Embryonen wurden mit einer Jenter-Eiersammelbox (Jenter Queen Rearing Kit, Karl Jenter GmbH, Frickenhausen, Deutschland) gesammelt und entweder injiziert oder bis zum Zielstadium bei 34 °C im Inkubator belassen55. Wildtyp-Puppen und adulte Tiere wurden aus Bienenvölkern gesammelt. Erwachsene Männchen und Weibchen des Wildtyps Cimex lectularius wurden von der Insect Services GmbH (Berlin, Deutschland) gekauft. Erwachsene Drosophila melanogaster aus dem isogenen Stamm w1118 waren ein Geschenk von Hermann Aberle (Heinrich-Heine-Universität Düsseldorf, Deutschland). Erwachsene Männchen und Weibchen von Tribolium castaneum waren ein Geschenk von Gregor Bucher (Universität Göttingen, Deutschland). Der Laborstamm AsymCx von Nasonia vitripennis wurde von einer Wolbachia-Infektion geheilt und kontinuierlich auf Calliphora sp. gezüchtet. Gastgeber bei 25 °C. Männliche und weibliche Wespen wurden anhand der geschlechtsspezifischen Vorderflügelgröße vor dem Schlüpfen getrennt. Nur männliche Nachkommen wurden erzeugt, indem jungfräulichen Weibchen Wirte angeboten wurden. Um weibliche Nachkommen zu zeugen, wurde ein jungfräuliches Weibchen mit einem einzelnen Männchen gepaart und durfte sich einen Tag lang paaren. Den einzelnen Weibchen wurden zwei Wirte pro Tag zur Verfügung gestellt, um die Eiablage einzuleiten.

Genomische DNA wurde mit dem innuPREP DNA Mini Kit (Analytik Jena, Jena, Deutschland) aus L1-Larven-, Königinnenbein- oder Puppenhinterbeingewebe der Honigbiene isoliert. RNA aus präpariertem Honigbienengewebe und erwachsenen D. melanogaster-, T. castaneum- oder C. lectularius-Menschen (drei gepoolte Individuen jedes Geschlechts) wurde mit der TRIzol-Methode (Thermo Fisher Scientific, Braunschweig, Deutschland) isoliert. RNA aus Larvenstadium 1, Embryonen oder aus Embryonenpools wurde mit dem innuPREP DNA/RNA Mini Kit (Analytik Jena, Jena, Deutschland) isoliert. Die cDNA wurde unter Verwendung des RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit und Oligo-dT- oder Random-Hexamer-Primern (Thermo Fisher Scientific, Braunschweig, Deutschland) synthetisiert. Anschließend wurde der zweite Strang mithilfe der DNA-Polymerase I21 synthetisiert. Die Reinigung der cDNA wurde mit dem EZNA Cycle Pure Kit (Omega Bio-Tek. Inc., Norcross, USA) durchgeführt. RNA aus N. vitripennis wurde mit ZR Tissue & Insect RNA MicroPrep™ (Zymo Research, Freiburg, Deutschland) mit On-Column-DNase-I-Behandlung (Thermo Fisher Scientific, Braunschweig, Deutschland) extrahiert. In diesem Fall wurde cDNA mit dem SensiFAST™ cDNA Synthesis Kit (Bioline, London, England) synthetisiert.

Phusion™ High-Fidelity DNA Polymerase (Thermo Fisher Scientific, Braunschweig, Deutschland) wurde für die RT-PCR verwendet, wenn die Amplifikate anschließend sequenziert werden sollten. Ansonsten wurde GoTaq® G2 Flexi DNA Polymerase (Promega, Walldorf, Deutschland) verwendet. Die PCR wurde mit einem Standardtemperaturprofil56 durchgeführt. Für die semiquantitative RT-PCR wurden die Menge an Template und die Anzahl der Zyklen entsprechend dem Referenzgen-Verlängerungsfaktor 1-alpha (Nv-ef1α, N. vitripennis; Cl-ef1α, C. lectularius; ef1α, A. mellifera) angepasst. und ribosomales Protein L32 (RPL32; D. melanogaster), um eine Sättigung auszuschließen und eine probenübergreifende Anpassung zu ermöglichen. Die verwendeten Oligonukleotide (Eurofins Genomics, Ebersberg, Deutschland) mit ihren Sequenzen sind in den Zusatzdaten 1 aufgeführt. Unbeschnittene und unverarbeitete Scans von Agarosegelen sind in der Quelldatendatei enthalten.

Die Exonstruktur von Glu (LOC552468) in A. mellifera wurde mithilfe von RNAseq-Daten27 und den über RT-PCR erhaltenen Amplikonsequenzen unter Verwendung von RNA bestimmt, die aus 25 bis 40 Stunden alten männlichen und weiblichen Honigbienenembryonen und Gehirngewebe weiblicher Puppen stammt. Domain-Suchen wurden mit PROSITE (https://prosite.expasy.org/)57, InterPro (https://www.ebi.ac.uk/interpro/)58 und der Pfam-Datenbank (https://pfam) durchgeführt. xfam.org)59. Homologe Proteine wurden durch BLASTP-Suchen in der NCBI-Datenbank mit signifikanter Ähnlichkeit identifiziert (https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi). Die identifizierten Gene waren LOC100678462 (Nv-glu; N. vitripennis), LOC106661925 (C. lectularius), LOC103312333 (T. castaneum) und CG12316 (D. melanogaster). Homologe Positionen und mögliche Grenzen kodierender Exons wurden anhand der Proteinsequenzen abgeleitet. Die Abstammungsstaaten wurden mithilfe der Methode der maximalen Sparsamkeit60 abgeleitet. Evolutionäre Sequenzanalysen wurden mit MEGA661 durchgeführt. Die in Abb. 7c dargestellten Sequenzen lauten wie folgt: A. mellifera XP_026299695.1; Bombus terrestris XP_012165493.2; Eufriesea mexicana OAD55885.1; Megachile-Rotunde XP_012146010.1; Acromyrmex echinatior XP_011060010.1; Polistes canadensis XP_014601325.1; N. vitripennis XP_003425013.1; Fopius arisanus XP_011314024.1; Orussus abientinus XP_012279333.1; Cephus cinctus XP_015598325.1; Neodiprion lecontei XP_015517082.1.

Zielstellen für sgRNAs wurden mit der Benchling-Software (https://benchling.com/) identifiziert. Die Zielstellen waren 20 nt lang, begannen mit einem 5'-Guanidin und zeigten mindestens drei Fehlpaarungen zu alternativen Zielen im Genom, den möglichen Off-Targets. PCR erzeugte DNA-Fragmente, die eine T7-RNA-Polymerase-Transkriptionsstartstelle, die Zielsequenz und die Cas9-Proteinbindungssequenz enthielten. sgRNAs (Sequenzen aufgeführt in Supplementary Data 1) wurden unter Verwendung des DNA-Fragments als Matrize und eines RiboMax-Kits (Promega, Walldorf, Deutschland) synthetisiert. Die sgRNAs wurden mit einem MEGAclear Kit (Thermo Fisher Scientific, Braunschweig, Deutschland) gereinigt und im Molverhältnis 2:1 mit 500 ng/µl Cas9-Protein (New England Biolabs, Frankfurt am Main, Deutschland) gemischt. Für die gezielte Mutation wurden 15–20 pg dsDNA pro 400 μl Injektionsmischung hinzugefügt. dsDNAs wurden gemäß der bereitgestellten Sequenz (Eurofins Genomics, Ebersberg, Deutschland) mit 250 bp flankierenden homologen Sequenzen hergestellt. Die Sequenzen wurden durch PCRs amplifiziert und vor der Injektion mit dem EZNA Cycle Pure Kit (Omega Bio-Tek Inc., Norcross, GA) gereinigt. Honigbienenembryonen (0–1,5 Stunden alt) wurden 400 μl sgRNA/Cas9-Gemisch injiziert und im Inkubator gehalten, bis die Larven schlüpften55,62. Die Aufzucht der Larven erfolgte mit 170 mg Arbeiternahrung (Gew./Vol. in sterilem Wasser: 50 % Gelée Royale, 15 % Glucose, 15 % Laktose, 1 % Hefeextrakt)63 bei 34 °C und 94 % Luftfeuchtigkeit bis zur Larvenbildung Stadium 5. Die Larven wurden in mit Filterpapier ausgestattete Petrischalen überführt und bis zum Puppenstadium 4 bei 34 °C und 75 % Luftfeuchtigkeit gehalten64. Für die Analyse von glu ex7-8 F-Männchen wurden injizierte weibliche Larven zu Königinnen herangezogen, und die männliche Eiablage wurde durch die CO2-Behandlung jungfräulicher Königinnen induziert55. Männliche Nachkommen wurden nach dem Schlüpfen eingesammelt und in kleinen Bienenstöcken in einem Inkubator mit jungen Arbeitsbienen gehalten. Die Phänotypisierung wurde an erwachsenen Männern 1–16 Tage nach dem Schlüpfen durchgeführt. Die injizierten Personen wurden auf die gewünschten Mutationen untersucht. Die Zielstelle der Mutationen wurde amplifiziert (DNA für Glu und cDNA für das Fem-Gen; Ergänzende Daten 1)21. Im ersten Schritt wurden die Individuen anhand von Längenunterschieden in den Amplikons vorgescreent. Personen mit glu ∆ex2-8/∆ex2-8-Deletionen und glu ex7-8 F-Mutationen wurden durch Auflösen der Amplifikate mittels Gelelektrophorese identifiziert. Für andere Mutationen wurden Fragmentlängenanalysen durch Kapillargelelektrophorese unter Verwendung von Hexachlorfluorescein-markierten Primern für PCR21 durchgeführt. Mutationen in glu ex7-8 F wurden durch Nukleotidsequenzierung weiter verifiziert. Wir identifizierten glu tmC2H2-Mutationen durch Restriktionsverdau von Amplifikaten mit dem Enzym PdiI (Thermo Fisher Scientific, Braunschweig, Deutschland) und Gelelektrophoresen. Die erkannten Längenvarianten wurden anhand der über die DNAseq von Amplifikaten erhaltenen Nukleotidsequenzen weiter validiert. Die Index-PCR wurde mit dem Nextera XT Index Kit (Illumina, San Diego, USA) durchgeführt und die Amplikons wurden mit Agencourt AMPure XP-Perlen (Beckman Coulter, Brea, USA) gereinigt. Die Vorbereitung und Sequenzierung der Bibliothek (2 × 250 bp Lesevorgänge) unter Verwendung des MiSeq Reagent Kit v2 (500 Zyklen; Illumina, San Diego, USA) wurde vom Zentrum für biologische und medizinische Forschung (BMFZ, Heinrich-Heine-Universität, Deutschland) nach Illumina durchgeführt Protokolle. Auf einem Illumina MiSeq-System (Illumina, San Siego, USA) wurden mindestens 78.000 Lesevorgänge pro Probe generiert. Rohsequenzen wurden mit dem Galaxy-Online-Toolset (http://usegalaxy.com)65 verarbeitet und analysiert. Sequenzen mit geringer Häufigkeit, die nicht miteinander in Zusammenhang standen (<5 % der Lesevorgänge), wurden ausgeschlossen21.

Zur Herstellung von dsRNAs (traF, Nv-glu, gfp: von grün fluoreszierendem Protein abgeleitete Sequenz) wurde ein MEGAscript RNAi Kit (Thermo Fisher Scientific, Braunschweig, Deutschland) verwendet. Nv-glu-dsRNA zielte auf den gemeinsamen Teil des Transkripts ab, der bei beiden Geschlechtern vorhanden ist. Die GFP-Sequenz wurde aus dem Vektor pOPINEneo-3C-GFP amplifiziert, der ein Geschenk von Ray Owens war (Addgene-Plasmid # 53534; http://n2t.net/addgene:53534; RRID: Addgene_53534). dsRNA Nv-traF wurde in weibliche Larven im 4. Stadium injiziert, während dsRNA Nv-glu in männliche und weibliche Larven im 2. Stadium injiziert wurde, beide in einer Konzentration von 4000 ng/μl. Der dsRNA-Lösung wurde Lebensmittelfarbstoff zugesetzt (1:9 v/v), um die Injektion zu steuern. Die Injektion in N. vitripennis-Larven66 erfolgte mit dem FemtoJet® 4i-Injektor (Eppendorf, Hamburg, Deutschland). Injizierte Larven im zweiten Stadium wurden auf ihre Pflegewirte übertragen (6–8 Larven pro Wirt), die auf 1X PBS-Platten platziert wurden66. Mit dsRNA Nv-traF behandelte Proben wurden 3, 4 und 5 Tage nach der Injektion gesammelt und gepoolt (n = 4 bis 5). dsRNA-Nv-glu-Proben wurden im Erwachsenenstadium zur Phänotypisierung gesammelt.

qRT-PCR wurde mit 3 bis 7 Replikaten auf einem CFX96TM Real-Time System (Bio-Rad, Hercules, USA) nach dem Verfahren des SensiFASTTM SYBR® No-ROX Kits (Bioline, London, England) durchgeführt. Nv-glu-qPCR-Primer wurden außerhalb der dsRNA-Zielregion entwickelt. Die Werte wurden mit der Software CFX Manager 3.1 (Bio-Rad, Hercules, USA) analysiert.

Die relativen Expressionsniveaus wurden mit der LinRegPCR-Software (LinRegPCR, 2017.1.0.0, HFRC, Amsterdam, Niederlande)67 berechnet. Der Nv-Glu-Knockdown wurde in zwei separaten Experimenten durchgeführt (ergänzende Abbildung 8).

Köpfe wurden aus Honigbienenpuppen präpariert und mit einem S8 APO-Binokularmikroskop (Leica, Wetzlar, Deutschland) mit einer UI-1240LE-C-HQ-Kamera (IDS, Obersulm, Deutschland) und uEye Cockpit (Teil der IDS-Suite v4.92) fotografiert. IDS, Obersulm, Deutschland) Software. Bilder für Messungen des Facettendurchmessers der hinteren Linse wurden mit einer Canon Eos 6d Mark II-Kamera und einem Canon MP-E65 mm 1:2,8 1–5× Marco-Objektiv (Tokio, Japan) aufgenommen. Bilder von erwachsenen Köpfen von N. vitripennis wurden mit einem digitalen Dino-Lite Edge 5MP-Mikroskop und der Software DinoCapture 2.0 (Dino-Lite, Almere, Niederlande) aufgenommen. Die Kopfparameter (Kopfbreite, Kopflänge, Augenbreite, Augenlänge und Augenabstand) wurden wie schematisch dargestellt gemessen (ergänzende Abbildung 11). Bei glu ex7-8 F-Männchen und Kontrollpersonen wurde der Linsenfacettendurchmesser im frontal-dorsalen Bereich des Auges gemessen, wo die Facetten bei Männern am größten sein sollten24. Für die Analyse wurde der Mittelwert von 15 zufällig gemessenen Linsenfacettendurchmessern pro Person verwendet. Längenmessungen wurden mit ImageJ (National Institute of Mental Health, USA) durchgeführt.

Datenstatistische Analysen wurden mit SigmaPlot 14.0 (Systat, San Jose, Vereinigte Staaten von Amerika) durchgeführt. Der Vergleich der Phänotypdaten wurde mittels zweiseitiger (oder einseitiger in Abb. 6c) Mann-Whitney-U-Tests analysiert. Für Vergleiche der Expressionsniveaus in N. vitripennis wurden Student-T-Tests angewendet. Die Diagramme der Daten zeigen die Mittelwerte und Standardabweichungen (Abb. 5c, f, 6c, 7d und ergänzende Abb. 1, 9, 10) oder Standardfehler (ergänzende Abb. 8). Es wurden keine Daten ausgeschlossen, mit Ausnahme der Knockdown-Phänotypdaten von N. vitripennis, bei denen das Injektionsverfahren allein zu extremen Ausreißern und Variationen bei den Größenphänotypen des Kopfes führte (ergänzende Abbildung 9). Wir haben das 1,5-fache der Standardabweichung als Kriterium verwendet, um solche Ausreißer68 aus den Kopfbreiten- oder -längendaten sowohl der Kontroll- als auch der behandelten Gruppe nach dem Verfahren zu entfernen (Abb. 7d und ergänzende Abb. 9). Berechnungen der Stichprobengröße wurden nicht durchgeführt. Stattdessen wurde die Stichprobengröße auf der Grundlage ähnlicher, zuvor veröffentlichter Studien zur Entwicklung von Honigbienen ausgewählt. Der Phänotyp jedes einzelnen Insekts ist auf unabhängige Mutations- oder Knockdown-Ereignisse zurückzuführen. Diese Datenpunkte stellen unabhängige biologische Replikate dar. Die Ermittler waren geblendet; Sie wussten bei der Phänotypisierung nicht, ob das Insekt zur Behandlungs-/Mutations- oder Kontrollgruppe gehört.

Weitere Informationen zum Forschungsdesign finden Sie in der mit diesem Artikel verlinkten Nature Portfolio Reporting Summary.

Die Autoren versichern, dass alle zur Bestätigung der Schlussfolgerungen des Artikels erforderlichen Daten im Artikel, in den Abbildungen, Zusatzinformationen und Daten oder in der Quelldatendatei enthalten sind. Zuvor veröffentlichte, hier analysierte RNA-seq-Daten sind in NIH GEO unter der Zugangsnummer GSE159387 verfügbar. Geschlechtsspezifische cds-Sequenzen des Glu-Gens wurden in der Datenbank NCBI unter den Zugangscodes OQ116780 und OQ116781 (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/gene) hinterlegt. Die Datenbanken PROSITE (https://prosite.expasy.org/)57, InterPro (https://www.ebi.ac.uk/interpro/)58, Pfam (https://pfam.xfam.org)59 und Das in dieser Studie verwendete BLASTP-Tool der NCBI-Datenbank (https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi) ist online zugänglich. Quelldaten werden mit diesem Dokument bereitgestellt.

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Wir danken Eva-Maria Theilenberg, Marion Müller-Borg, Maryam Masrouri und Ann-Christin Langen für ihre Unterstützung bei der Bienenbehandlung und Analyseunterstützung. Wir danken Michael Griese für die Bereitstellung der Bienenvölker. Wir danken Steffen Köhler für die Makroaufnahmen der Facettenaugen. Drosophila melanogaster-Fruchtfliegen waren ein Geschenk von Hermann Aberle (Heinrich-Heine-Universität Düsseldorf, Deutschland) und Tribolium castaneum-Käfer waren ein Geschenk von Gregor Bucher (Universität Göttingen, Deutschland). Wir danken Daniel Bopp für seine sehr hilfreichen Kommentare zu einer frühen Version des Manuskripts. Die Amplikonsequenzierung und die Sequenzierungsqualitätskontrolle wurden vom Biologischen und Medizinischen Forschungszentrum (BMFZ) der Universität Düsseldorf (Deutschland) durchgeführt. Das Honigbienenprojekt wurde von der Deutschen Forschungsgemeinschaft gefördert (Fördernummern BE 2194/13-3, BE 2194/10-3; http://www.dfg.de/).

Open-Access-Förderung ermöglicht und organisiert durch Projekt DEAL.

Institut für Evolutionäre Genetik, Heinrich-Heine-Universität, Düsseldorf, Deutschland

Oksana Netschitailo, Anna Wagner, Vivien Sommer & Martin Beye

Labor für Entomologie, Universität Wageningen, Wageningen, Niederlande

Yidong Wang & Eveline C. Verhulst

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Konzeptualisierung, ON und MB; Methodik, ON und YW; Validierung, ON und MB; Formale Analyse, ON und YW; Untersuchung, ON, YW, VS und AW; Schreiben – Originalentwurf, ON und MB; Schreiben – Überprüfen und Bearbeiten, ON, MB, YW und EV; Visualisierung, EIN; Supervision, EV und MB; Fördermittelakquise, MB

Korrespondenz mit Oksana Netschitailo oder Martin Beye.

Die Autoren geben an, dass keine Interessenkonflikte bestehen.

Nature Communications dankt Michael Perry, Giuseppe Saccone und den anderen, anonymen Gutachtern für ihren Beitrag zum Peer-Review dieser Arbeit.

Anmerkung des Herausgebers Springer Nature bleibt hinsichtlich der Zuständigkeitsansprüche in veröffentlichten Karten und institutionellen Zugehörigkeiten neutral.

Open Access Dieser Artikel ist unter einer Creative Commons Attribution 4.0 International License lizenziert, die die Nutzung, Weitergabe, Anpassung, Verbreitung und Reproduktion in jedem Medium oder Format erlaubt, sofern Sie den/die ursprünglichen Autor(en) und die Quelle angemessen angeben. Geben Sie einen Link zur Creative Commons-Lizenz an und geben Sie an, ob Änderungen vorgenommen wurden. Die Bilder oder anderes Material Dritter in diesem Artikel sind in der Creative Commons-Lizenz des Artikels enthalten, sofern in der Quellenangabe für das Material nichts anderes angegeben ist. Wenn Material nicht in der Creative-Commons-Lizenz des Artikels enthalten ist und Ihre beabsichtigte Nutzung nicht durch gesetzliche Vorschriften zulässig ist oder über die zulässige Nutzung hinausgeht, müssen Sie die Genehmigung direkt vom Urheberrechtsinhaber einholen. Um eine Kopie dieser Lizenz anzuzeigen, besuchen Sie http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/.

Nachdrucke und Genehmigungen

Netschitailo, O., Wang, Y., Wagner, A. et al. Die Funktion und Entwicklung eines genetischen Schalters, der die sexuell dimorphe Augendifferenzierung bei Honigbienen steuert. Nat Commun 14, 463 (2023). https://doi.org/10.1038/s41467-023-36153-4

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Eingegangen: 29. Januar 2022

Angenommen: 18. Januar 2023

Veröffentlicht: 28. Januar 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s41467-023-36153-4

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