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Wissenschaftliche Berichte Band 12, Artikelnummer: 21165 (2022) Diesen Artikel zitieren

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Bakterielle und virale Infektionen sind ein ernstes Problem für die öffentliche Gesundheit. Daher zielte diese Studie darauf ab, das antibakterielle, antibiofilmische und antivirale Potenzial des rohen hydroalkoholischen Extrakts, der Fraktionen und der isolierten Verbindungen des brasilianischen Roten Propolis (BRP) sowie deren In-vivo-Toxizität zu bewerten. Die antibakterielle Aktivität wurde durch Bestimmung der minimalen Hemmkonzentration und die Antibiofilmaktivität durch Bestimmung der minimalen Hemmkonzentration des Biofilms (MICB50) bewertet. Die Anzahl lebensfähiger Bakterien (Log10 UFC/ml) wurde ebenfalls ermittelt. Die antiviralen Tests wurden durch Infektion von BHK-21-Zellen mit Chikungunya (CHIKV) nanoluc durchgeführt. Die Toxizität des BRP wurde im Tiermodell Caenorhabditis elegans bewertet. Die MHK-Werte für die Probe des rohen hydroalkoholischen Extrakts lagen zwischen 3,12 und 100 μg/ml, während die MHK-Werte für Fraktionen und isolierte Verbindungen zwischen 1,56 und 400 μg/ml lagen. Der rohe wässrig-alkoholische Extrakt von BRP, Oblongifolin B und Gutiferon E zeigten MHK50-Werte im Bereich von 1,56 bis 100 μg/ml gegen Monospezies- und Multispezies-Biofilme. Neovestitol und Vestitol hemmten die CHIKV-Infektion um 93,5 bzw. 96,7 %. Die Tests zur Bewertung der Toxizität bei C. elegans zeigten, dass das BRP unterhalb der Konzentrationen von 750 μg/ml nicht toxisch war. Die Ergebnisse stellen einen alternativen Ansatz zur Behandlung verschiedener Infektionskrankheiten dar.

Trotz wichtiger Fortschritte im Gesundheitsbereich stellen Infektionskrankheiten im Laufe der Zeit ein ernstes Problem für die öffentliche Gesundheit dar1. Ein Beispiel ist Parodontitis, eine entzündliche Erkrankung, die den Zahnhalteapparat betrifft und durch Mikroorganismen verursacht wird, die in Plaque-Biofilmen der Dysbiose vorhanden sind2. Laut Mehrotra und Singh3 wurde bei etwa 2,6 % der Afroamerikaner, 5 % der Afrikaner, 0,2 % der Asiaten, 1 % der Nordamerikaner und 0,3 % der Südamerikaner Parodontitis in ihrer schwersten Form diagnostiziert. Eine parodontale Behandlung ist nicht nur für die Zahnparameter unerlässlich, sondern auch zur Vermeidung anderer pathologischer Zustände wie Nebenwirkungen in der Schwangerschaft, Herz-Kreislauf- und Atemwegserkrankungen, Krebs, Lupus, rheumatoider Arthritis, Diabetes mellitus und chronischer Nierenerkrankung4. Selbst wenn die Krankheit mit Antibiotika behandelt werden kann, kann sich die Infektion bei Patienten ohne Behandlung oder bei Vorhandensein resistenter parodontopathogener Bakterien verschlimmern5.

Viruserkrankungen belasten auch das globale Gesundheitssystem aufgrund des Mangels an Impfstoffen und zugelassenen Virostatika zur Bekämpfung wichtiger menschlicher Viren, darunter das Chikungunya-Fieber, das durch das Chikungunya-Virus (CHIKV) verursacht wird6. CHIKV wurde 2014 identifiziert und ist in Brasilien hyperendemisch geworden7. Dieses Virus verursacht Dengue-ähnliche Symptome wie Fieber, Müdigkeit, Arthralgie und Polyarthralgie8. Bis April 2022 wurden in Brasilien 28.291 Verdachtsfälle von Chikungunya-Fieber registriert und fünf Todesfälle bestätigt; weitere acht Todesfälle werden untersucht9.

Nach Angaben der Weltgesundheitsorganisation ist ein erheblicher Teil der Weltbevölkerung immer noch auf traditionelle Medizin angewiesen und setzt Naturprodukte zur Behandlung verschiedener Krankheiten ein10. Solche Produkte werden vor allem in Entwicklungsländern eingesetzt. In diesem Szenario ist Brasilien eine wertvolle Quelle für Naturprodukte, da es über eine vielfältige Fauna und Flora verfügt11. Brasilianisches rotes Propolis (BRP), ein harziges Material, das von Apis mellifera-Bienen durch das Sammeln der Exsudate zweier Pflanzenarten hergestellt wird: Dalbergia ecastaphyllum12,13 und Symphonia globulifera14, hat ein hervorragendes Potenzial für die Entwicklung neuer Arzneimittel. BRP ist derzeit eine der am meisten produzierten und kommerzialisierten Arten von brasilianischem Propolis. Es kommt hauptsächlich in den brasilianischen Mangroven im Nordosten vor, insbesondere in den Bundesstaaten Alagoas und Bahia15.

BRP besteht aus 50 % Harz, 30 % Wachs, 10 % ätherischen Ölen, 5 % Pollen und 5 % anderen Verbindungen, einschließlich Sekundärmetaboliten wie Flavonoiden, Isoflavonoiden, Zimtsäurederivaten, Estern, polyprenylierten Benzophenonen und einigen Terpenen gelten als die wichtigsten biologisch aktiven Bestandteile dieser Art von Propolis16. Die aus BRP isolierten Moleküle kommen in keinem anderen Propolistyp vor, was sie zu seltenen und einzigartigen Naturprodukten macht17. Variationen dieser Zusammensetzung wurden zwischen Standorten beobachtet. Einige Studien ergaben, dass Verbindungen wie Formononetin und Isoliquiritigenin in Proben von Alagoas am häufigsten vorkommen18. Stattdessen wurden in der „Canavieiras“-Probe Vestitol, Neovestitol, Medicarpin und polyprenylierte Benzophenone als Hauptverbindungen identifiziert und17. In diesem Sinne wurde berichtet, dass BRP antibakterielle15,18,19,20 antiparasitäre21,22,23,24,25,26,27 und antivirale Aktivitäten28 besitzt.

Angesichts des Mangels an Behandlungsmöglichkeiten für Parodontitis und CHIKV-Infektionen haben wir die Hypothese aufgestellt, dass BRP und seine isolierten Verbindungen ein vielversprechender Kandidat für die Behandlung dieser Krankheiten sind. Nach unserem besten Wissen liegen keine Daten zur antiviralen Wirkung von BRP gegen CHIKV vor, und nur wenige Studien haben über seine antibakterielle Wirkung gegen parodontopathogene Bakterien berichtet13,18,28,29,30. Der Einsatz von BRP als therapeutische Option könnte den Einsatz von Antibiotika bei Parodontitisfällen reduzieren und zu einer neuartigen antiviralen Strategie gegen CHIKV28 werden.

Ziel dieser Studie war es, das antibakterielle, antibiofilmische und antivirale Potenzial des rohen hydroalkoholischen BRP-Extrakts, der Fraktionen und der isolierten Verbindungen in vitro sowie deren Toxizität in einem In-vivo-Modell zu bewerten.

Die chromatographische Analyse ergab das Vorhandensein von Isoflavanen (Vestitol, Neovestitol, 7-O-Methylvestitol), Pterocaparnen (Medicarpin) und polyprenylierten Acylphloroglucinolen (eine Mischung aus Guttiferon E/Xanthochymol und Oblongifolin B) (Abb. 1) als Hauptverbindungen des BRP. Das chromatographische Profil der Fraktionen zeigte das deutliche Vorhandensein von polyprenylierten Acylphloroglucinolen in der Hexanfraktion, wohingegen die Dichlormethan-, Ethylacetat- und n-Butanolfraktionen hauptsächlich aus Isoflavanen bestanden (siehe ergänzende Abbildung S1).

Chromatographisches Profil des brasilianischen roten Propolis-Extrakts und chemische Strukturen seiner Hauptverbindungen. Die Zahlen entsprechen: Vestitol (1); Neovestitol (2); Medicarpin (3); 7-O-Methylvestitol (4); Guttiferon E/Xanthochymol 59; und Oblongifolin B (6).

Tabellen 1 und 2 zeigen die MHK-Ergebnisse für den rohen hydroalkoholischen Extrakt, Fraktionen und isolierte Verbindungen gegen Parodontalbakterien, die in die Studie einbezogen wurden. Die MHK-Werte für die rohe hydroalkoholische Extraktprobe lagen zwischen 3,12 und 100 μg/ml, für die Dichlormethanfraktion zwischen 1,56 und 200 μg/ml, für Ethylacetat zwischen 12,5 und 400 μg/ml, für Hexan zwischen 3,12 und 400 μg/ml n-Butanol von 100 bis 400 μg/ml (Tabelle 1).

Für Methylvestitol lagen die MHK-Werte zwischen 25 und 400 μg/ml, Medicarpin zwischen 50 und 400 μg/ml, Vestitol zwischen 12,5 und 200 μg/ml, Neovestitol zwischen 12,5 und 100 μg/ml und Oblongifolin B zwischen 3,12 und 50 μg /ml und Guttiferon E von 1,56 bis 200 μg/ml (Tabelle 2).

Der hydroalkoholische BRP-Rohextrakt reduzierte die Monospezies-Biofilmbildung der Standardstämme (ATCC) und ihrer klinischen Isolate (Abb. 2). Darüber hinaus nahm die Anzahl lebensfähiger Zellen im Monospezies-Biofilm, ausgedrückt als Log10 KBE/ml, ab (Abb. 2). Der niedrigste MICB50-Wert, der für den hydroalkoholischen BRP-Rohextrakt gegen die Monospezies-Biofilme erhalten wurde, betrug 3,12 μg/ml gegen A. naeslundii (ATCC 19039) und F. nucleatum (klinisches Isolat) (Abb. 2e und f). Im Vergleich zu den anderen bewerteten Monospezies-Biofilmen wies der hydroalkoholische BRP-Rohextrakt eine MICB50 von 6,25 μg/ml auf, mit Ausnahme von P. intermedia (klinisches Isolat), bei dem die MICB50 12,5 μg/ml betrug. Selbst bei Konzentrationen über MICB50 konnten wir jedoch lebensfähige Biofilmzellen nachweisen (Abb. 2a – f).

Antibiofilm-Aktivität von rohen hydroalkoholischen Extraktproben aus brasilianischem Rotem Propolis und Anzahl lebensfähiger Zellen in Monospezies-Biofilmen, die von den in die Studie einbezogenen ATCC-Stämmen und klinischen Isolaten gebildet werden. (a) P. gingivalis (ATCC 49417). (b) P. gingivalis (klinisches Isolat). (c) P. intermedia (ATCC 15033). (d) P. intermedia (klinisches Isolat). (e) A. naeslundii (ATCC 19039). (f) F. nucleatum (klinisches Isolat).

Die getesteten isolierten Verbindungen reduzierten auch die Bildung von Monospezies-Biofilmen. In Gegenwart von Oblongifolin B (Abb. 3) betrug der niedrigste MICB50-Wert 0,78 μg/ml gegen A. naeslundii (ATCC 19039) (Abb. 3c). Im Vergleich zu den anderen bewerteten Monospezies-Biofilmen lagen die MICB50-Werte zwischen 1,56 und 6,25 μg/ml. Oblongifolin B eliminierte bei 6,25 μg/ml lebensfähige Zellen von P. gingivalis (klinisches Isolat) und bei 12,5 μg/ml eliminierte es lebensfähige Zellen von P. intermedia (ATCC 15033) und F. nucleatum (klinisches Isolat) (Abb. 3a, b). und d).

Antibiofilmaktivität von Oblongifolin B und Anzahl lebensfähiger Zellen in Monospezies-Biofilmen, die von in die Studie einbezogenen ATCC-Stämmen und klinischen Isolaten gebildet werden. (a) P. intermedia (klinisches Isolat) (b) P. intermedia (ATCC 15033). (c) A. naeslundii (ATCC 19039). (d) F. nucleatum (klinisches Isolat).

Guttiferon E zeigte einen niedrigen MICB50-Wert (0,78 μg/ml) gegen A. naeslundii (ATCC 19.039) (Abb. 4d). Im Vergleich zu den anderen bewerteten Monospezies-Biofilmen lag der MICB50-Wert im Bereich von 1,56 bis 25 μg/ml (Abb. 4a, b, c und e). Guttiferon E eliminierte alle Biofilmzellen ab einer Konzentration von 3,12 μg/ml gegen P. gingivalis (klinisches Isolat), 6,25 μg/ml gegen P. intermedia (ATCC 15033), 25 μg/ml gegen F. nucleatum (klinisches Isolat), und 1,56 μg/ml gegen A. naeslundii (ATCC 19039). Für P. gingivalis (ATCC 49417) haben wir das Vorhandensein lebensfähiger Biofilmzellen auch bei Konzentrationen über MICB50 nachgewiesen (Abb. 4a).

Antibiofilmaktivität von Guttiferon E und Anzahl lebensfähiger Zellen in Monospezies-Biofilmen, die von in die Studie einbezogenen ATCC-Stämmen und klinischen Isolaten gebildet werden. (a) P. gingivalis (ATCC 49417). (b) P. gingivalis (klinisches Isolat). (c) P. intermedia (ATCC 15033). (d) A. naeslundii (ATCC 19039). (e) F. nucleatum (klinisches Isolat).

Wir haben auch die Aktivität des rohen hydroalkoholischen BRP-Extrakts und der isolierten Verbindungen gegen Multispezies-Biofilm untersucht, der von Standardstämmen (Gruppe 1) und klinischen Isolaten (Gruppe 2) gebildet wird (Abb. 5). Der hydroalkoholische BRP-Rohextrakt hatte einen MICB50-Wert von 6,25 μg/ml gegen den Multispezies-Biofilm der Gruppe 1. Allerdings wurden selbst bei höheren Konzentrationen immer noch lebensfähige Zellen im Biofilm gefunden. Ähnliche Ergebnisse wurden für den Multispezies-Biofilm der Gruppe 2 gefunden: MICB50 betrug 6,25 μg/ml, und es gab auch lebensfähige Biofilmzellen oberhalb der MICB50-Konzentration (Abb. 5A).

Antibiofilmaktivität von Proben von rohem hydroalkoholischem Extrakt aus brasilianischem Rotem Propolis, Oblongifolin B und Guttiferon E und Anzahl lebensfähiger Zellen in Multispezies-Biofilmen, die von Bakterien der Gruppen 1 (Standardstämme) und 2 (klinische Isolate) gebildet werden. (A) Rohextrakt. (B) Oblongifolin B. (C) Guttiferon E.

Oblongifolin B wies den niedrigsten MICB50-Wert gegenüber dem Multispezies-Biofilm der Gruppe 1 auf (1,56 μg/ml); Bei Konzentrationen über MICB50 blieben die Zellen jedoch im Biofilm lebensfähig. Gegen den Multispezies-Biofilm der Gruppe 2 zeigte Oblongifolin B einen MICB50-Wert von 50 μg/ml und eliminierte bei derselben Konzentration alle Biofilmzellen aus dem Biofilm (Abb. 5B). Andererseits zeigte Guttiferon E einen MICB50-Wert von 3,12 μg/ml gegen den Multispezies-Biofilm der Gruppe 1, und 6,25 μg/ml Guttiferon E eliminierte alle Zellen aus dem Biofilm. Gegenüber dem Multispezies-Biofilm der Gruppe 2 hatte Guttiferon E einen höheren MICB50-Wert (100 μg/ml), aber 50 μg/ml Guttiferon E eliminierte auch alle lebensfähigen Zellen aus dem Biofilm (Abb. 5C).

In Bezug auf die Kontrolle (Metronidazol) lag der MICB50-Wert von Monospezies-Biofilmen zwischen 2,95 und 5,9 μg/ml. Bei den gemischten Biofilmen betrug die MICB50 2,95 μg/ml sowohl für den von Gruppe 1 gebildeten Biofilm als auch für den von Gruppe 2 gebildeten Biofilm (siehe ergänzende Materialien, Abbildungen S2 und S3).

Um die Wirkung des BRP-Extrakts und seiner isolierten Verbindungen weiter zu bewerten, wurden BHK 21-Zellen mit jedem Extrakt in einer Konzentration von 50, 10 und 2 μg/ml behandelt und die Lebensfähigkeit der Zellen wurde 16 Stunden später gemessen. Die Ergebnisse zeigten, dass die Zellen n-Butanol bei 50 μg/ml (98,4 %), Ethylacetat bei 10 μg/ml (95,9 %) tolerierten, während der Rohextrakt, Dichlormethan und Hexan bei 2 μg/ml (99,3, 99,8, bzw. 100 %), (Tabelle 3). Durch den Einsatz von mit CHIKV-nanoluc infizierten BHK-21-Zellen wurden die Anti-CHIKV-Aktivitäten jeder Probe bei den durch den Lebensfähigkeitstest ausgewählten maximalen nicht-zytotoxischen Konzentrationen bewertet. Die Ergebnisse zeigten, dass n-Butanol die CHIKV-Replikation um 69 % signifikant hemmte (Abb. 6). Die anderen Proben zeigten keinen Einfluss auf die CHIKV-Infektion (Abb. 6).

Zelllebensfähigkeit und CHIKV-Replikationsraten in Gegenwart von rohem hydroalkoholischem Extrakt und Fraktionen aus brasilianischem rotem Propolis.

Für die isolierten Substanzen (Medicarpin, Neovestitol, Vestitol, Oblongifolin B, Methylvestitol und Guttiferon E) wurden BHK-21-Zellen mit Konzentrationen jeder Verbindung im Bereich von 32 bis 0,5 μg/ml behandelt. Als Ergebnis ergab die Behandlung mit Verbindungen in Konzentrationen über 3 µg/ml Zelllebensfähigkeitsraten von mehr als 80 % (Tabelle 4), und für den antiviralen Test wurde die höchste nicht-zytotoxische Konzentration jeder Verbindung ausgewählt. Da Medicarpin, Neovestitol und Vestitol bei 14 µg/ml Zytotoxizität aufwiesen (Tabelle 4) und bei 3 µg/ml keine antivirale Aktivität zeigten (Ergänzende Abbildung S4), wurde für die weiteren Tests die alternative Konzentration von 11 µg/ml ausgewählt. Daher wurde die antivirale Aktivität von Medicarpin, Neovestitol und Vestitol bei 11 µg/ml, Guttiferon E und Oblongifilin B bei 6 µg/ml und Methylvestitol bei 14 µg/ml getestet. Die Verbindungen Medicarpin, Neovestitol und Vestitol hemmten die CHIKV-Replikation in vitro zu 86 %, 94 % bzw. 97 % (Abb. 7).

Auswirkungen isolierter Verbindungen auf die CHIKV-Infektion und die Lebensfähigkeit der Zellen.

Um die Toxizität des BRP-Rohwasserextrakts und isolierter Verbindungen in einem In-vivo-System zu beurteilen, wurde die Technik zur Bestimmung der niedrigsten Konzentration, die 50 % (LC50) der Larven im Verhältnis zur Inkubationszeit abtöten kann, eingesetzt. Abbildung 8 zeigt die Toxizitätsbewertung des rohen hydroalkoholischen BRP-Extrakts, Oblongifolin B und Guttiferon E als Funktion von Zeit und Konzentration. Der LC50-Wert des rohen hydroalkoholischen BRP-Extrakts und Oblongifolin B betrug 1500 μg/ml, bestimmt am zweiten Tag der Inkubation (Abb. 8A und B). Andererseits hatte Guttiferon E einen LC50-Wert von 750 μg/ml, bestimmt am letzten Tag der Inkubation (Abb. 8C).

Bewertung der Toxizität des brasilianischen hydroalkoholischen Rohextrakts aus rotem Propolis und der isolierten Verbindungen Guttiferon E und Oblongifolin B im C. elegans-In-vivo-Modell. (A) Roher hydroalkoholischer Extrakt. (B) Oblongifolin B. (C) Guttiferon E.

Propolis wird in der Volksmedizin seit Jahren zur Behandlung von Infektionen eingesetzt und sein antimikrobielles Potenzial wurde von der wissenschaftlichen Gemeinschaft nachgewiesen15. Dieses biologische Potenzial lässt sich auf seine differenzierte chemische Zusammensetzung zurückführen.

Sesquiterpene, Pterocarpane und Isoflavane charakterisieren brasilianisches rotes Propolis. Die chemische Zusammensetzung von rotem Propolis unterscheidet sich stark von anderen Propolis-Typen, wie z. B. braunem Propolis, das durch Kohlenwasserstoffe, Aldehyde und Monoterpene gekennzeichnet ist; und grünes Propolis, das durch polyzyklische aromatische Kohlenwasserstoffe, Sesquiterpene und Naphthalinderivate gekennzeichnet ist31.

Vestitol, Neovestitol und Medicarpin wurden als Hauptbestandteile in rotem Propolis aus Canavieiras, Bundesstaat Bahia, Brasilien, gemeldet. Dagegen wurden Formononetin, Calycosin, Biochanin A und Isoliquiritigenin in geringeren Konzentrationen nachgewiesen17. Guttiferon E und Oblongifolin B wurden als chemische Marker für rotes Propolis beschrieben14, sie scheinen jedoch in der untersuchten Probe im Vergleich zu den Isoflavanen in geringeren Konzentrationen vorzuliegen. Die Triterpene β-Amyrin und Glutinol wurden von diesem Standort aus auch in BRP beschrieben14.

Laut Rios und Recio32 und Gibbons33 gelten MHK-Werte unter 100 µg/ml für rohen hydroalkoholischen Extrakt oder unter 10 µg/ml für isolierte Verbindungen als vielversprechend, wenn es um die Bewertung der antibakteriellen Aktivität von Pflanzenextrakten, ätherischen Ölen und aus natürlichen Quellen isolierten Verbindungen geht. Auf der Grundlage dieser Kriterien und unter Berücksichtigung der hier dargestellten MHK-Werte für alle bewerteten BRP-Proben zeigten der hydroalkoholische BRP-Rohextrakt und die isolierten Verbindungen Guttiferon E und Oblongifolin B die beste Hemmwirkung gegen die meisten bewerteten Bakterien.

Die rote Propolis-Dichlormethan-Fraktion wurde nicht getestet, da die Auswahl auf der Wirkung der einzelnen Bestandteile jeder Fraktion beruhte. Die Hauptverbindungen der Hexan-Fraktion, Oblongifolin B und Guttiferon E, zeigten bei den einzelnen Tests eine gute Aktivität im Vergleich zu den einzelnen Verbindungen der Dichlormethan-Fraktion.

Diese Proben zeigten antibakterielle Aktivität vor allem gegen P. gingivalis (ATCC 49417), die als die klinisch wichtigste Spezies bei der Entstehung parodontaler Erkrankungen gilt34, und gegen F. nucleatum-Bakterien (klinisches Isolat), die ebenfalls als relevanter Krankheitserreger gelten, da sie Zahnfleischentzündungen und Zahnverlust verschlimmern35 . Diese Ergebnisse zeigten die Relevanz dieser Naturprodukte für die Kontrolle und Behandlung von Parodontalerkrankungen. In dieser Arbeit wurden der rohe hydroalkoholische Extrakt von BRP, Fraktionen (n-Hexan, Dichlormethan, Ethylacetat und n-Butanol) und isolierte Verbindungen (Methylvestitol, Medicarpin, Vestitol, Neovestitol, Oblongifolin B und Guttiferon E) auf ihre Eigenschaften analysiert antibakterielle Aktivität gegen klinische Isolate und die ATCC-Stämme. Die ATCC-Stämme seien genetisch stabiler und würden somit die Bakterienart repräsentieren, was einen Vergleich mit anderen Untersuchungen ermöglichen würde. Der In-vitro-Test liefert einen zuverlässigen Hinweis darauf, wie der Mikroorganismus auf den Zielwirkstoff reagiert, und eine Extrapolation der Ergebnisse für diese Art oder sogar Gattung sollte akzeptiert werden. Bei klinischen Isolaten (auch Wildstämme genannt) handelt es sich um Bakterien, deren Stoffwechsel durch Umweltbedingungen und deren Genetik durch die Verbreitung in der Bevölkerung verändert werden kann, was die Relevanz der Bewertung dieser beiden Arten von Stämmen rechtfertigen würde.

Die MHK-Werte (1,56–400 µg/ml) für die anderen untersuchten Bakterien waren im Vergleich zu Literaturdaten deutlich niedriger. Bueno-Silva et al.29 bewerteten die antibakterielle Aktivität des Rohextrakts und der isolierten Verbindungen Neovestitol und Vestitol, die aus BRP desselben botanischen Ursprungs gewonnen wurden, gegen A. naeslundii (ATCC 12104) und berichteten über MHK-Werte von 25, 25 und 50 µg/ml. Hier waren Neovestitol und Vestitol gegen mehrere der untersuchten parodontalen Bakterien nicht erfolgversprechend. Ein weiterer hervorzuhebender Punkt ist, dass der von Bueno-Silva et al.29 gegen A. naeslundii (ATCC 12104) berichtete MHK-Wert für den Rohextrakt dem Wert ähnelte, den wir gegen A. naseslundii (ATCC 19039) erhalten haben, was auf eine Art-Anfälligkeitsbeziehung für hindeutet der Rohextrakt.

Santos et al.36 untersuchten die antibakterielle Aktivität des wässrigen hydroalkoholischen Extrakts und der Fraktionen (Hexan, Dichlormethan und Ethylacetat), die aus einer anderen Art von Propolis aus der Region „Cachoeira da Prata“, Minas Gerais – Brasilien, gewonnen wurden auch von Apis mellifera-Bienen gesammelt. Bei den getesteten Bakterien handelte es sich um parodontale F. nucleatum (ATCC 10953), P. gingivalis (ATCC 33277) und P. intermedia (ATCC 25611). Der Extrakt ergab MHK-Werte von 1024, 256 und 256 µg/ml gegen F. nucleatum (ATCC 10953), P. gingivalis (ATCC 33277) bzw. P. intermedia (ATCC 25611). Bei den Fraktionen lagen die MHK-Werte zwischen 512 und > 1024 µg/ml. Die MHK-Ergebnisse gegen diese Bakterien waren höher als die hier dargestellten für den rohen hydroalkoholischen BRP-Extrakt und Fraktionen gegen dieselbe Bakterienart, aber von unterschiedlichen Stämmen: Wir fanden MHK-Werte von 100, 3,12 und 6,25 µg/ml für den Rohextrakt gegen F . nucleatum (ATCC 10953), P. gingivalis (ATCC 49417) bzw. P. intermedia (ATCC 15033). Bei den Fraktionen fanden wir MHK-Werte zwischen 12 und 400 µg/ml gegen die gleichen Bakterien. Daher waren im Vergleich zu den von diesen Autoren beschriebenen Ergebnissen der hier verwendete hydroalkoholische BRP-Rohextrakt und die verwendeten Fraktionen wirksamer gegen parodontale Bakterien.

Darüber hinaus verglichen diese Autoren die MIC-Ergebnisse, die sie durch ANOVA-Analyse mit dem Rohextrakt und den Fraktionen erhalten hatten. Sie fanden keine Unterschiede in der antibakteriellen Aktivität der Fraktionen oder des Extrakts gegenüber den untersuchten Bakterien. Dies bestätigt unsere Ergebnisse: Der hydroalkoholische BRP-Rohextrakt war vielversprechender als die Fraktionen und ergab bessere Werte gegen alle bewerteten Bakterien, während die Fraktionen nur gegen zwei Bakterien eine antibakterielle Aktivität aufwiesen (P. gingivalis ATCC 49417 und klinisches Isolat).

Shabbir et al.37 bewerteten die Aktivität des in Skardu (Pakistan) gesammelten rohen Propolisextrakts, der aus Robinia pseudoacacia, Elegnus agustifolia (russischer Olive) und Acacia modesta stammt und von Apis mellifera-Bienen gesammelt wurde. Die natürlichen Produkte lieferten MHK-Werte im Bereich von 64 bis 512 µg/ml gegen klinische Isolate von P. gingivalis und P. intermedia. Unsere Ergebnisse deuten darauf hin, dass BRP wirksamer ist als das von Shabbir et al.37 verwendete Propolis, da die MHK-Werte, die wir für den rohen hydroalkoholischen BRP-Extrakt gegen klinische Isolate von P. gingivalis und P. intermedia erhalten haben, niedriger waren (12,5 und 6,25 µg/ml, jeweils). Daher erwies sich BRP als vielversprechender als Propolis aus anderen Ländern, da es aus einzigartigen Verbindungen besteht, die normalerweise in anderen Propolisarten nicht vorkommen15.

Die Hemmung der Biofilmbildung durch diese Bakterien kann zur Reduzierung von Parodontitis beitragen. Tatsächlich haben Al-Ahmad et al.38 beschrieben, dass A. naeslundii und F. nucleatum die Rolle des ersten kolonisierenden Bakteriums bzw. des späten Kolonisators spielen. Es wurde gezeigt, dass das letztgenannte Bakterium nach 62 Stunden der Biofilmbildung mit einer Rate von mehr als 50 % vorhanden war, was zu verstärkter Entzündung und Zahnverlust beitrug38.

In anderen Studien wurde die Antibiofilmaktivität von BRP-Monospezies gegenüber anderen Bakterienarten untersucht. de Souza Silva et al.39 bewerteten die Antibiofilmaktivität des BRP-Rohwasser-Alkohol-Extrakts (BRP, das in der gleichen Region wie das in unserer Studie verwendete BRP gesammelt wurde), das auf Polymernanopartikeln aufgetragen war, gegen Staphylococcus aureus (ATCC 25923), Staphylococcus aureus (ATCC 33591). , Staphylococcus aureus (ATCC 43300) und Pseudomonas aeruginosa (ATCC 27853). Der freie hydroalkoholische BRP-Rohextrakt und der mit Nanopartikeln beschichtete Extrakt hemmten den von den grampositiven Stämmen gebildeten Biofilm wirksamer als den von den gramnegativen Stämmen gebildeten Biofilm, wobei die Biofilm-hemmenden Konzentrationswerte zwischen 15,6 und 125 μg/ml lagen gegen die S. aureus-Stämme und von 100 bis 1560 μg/ml gegen den P. aeruginosa-Stamm. Diese Ergebnisse bestätigten unsere Ergebnisse, da wir die niedrigsten MICB50-Werte gegen das grampositive Bakterium A. naeslundii (ATCC 19039) verifiziert haben: 3,12 μg/ml für den Rohextrakt und 0,78 μg/ml für die isolierten Verbindungen Oblongifolin B und Guttiferon E.

Miranda et al.13 bewerteten die Antibiofilmaktivität des rohen hydroalkoholischen Extrakts von BRP aus demselben botanischen Ursprung wie das hier verwendete BRP. Diese Autoren teilten die untersuchten Bakterien in Komplexe ein (Actinomyces, lila, gelb, grün, orange, rot und andere). Bei Extraktkonzentrationen von 800 und 1.600 μg/ml zeigten die Autoren einen Rückgang der Stoffwechselaktivität der von diesen Komplexen gebildeten Multispezies-Biofilme um 40 bzw. 45 %. de Figueiredo et al.30 bewerteten auch die Antibiofilmaktivität des BRP-Rohextrakts bei 1600, 800 und 400 μg/ml und erzielten eine Reduzierung der Biofilm-Stoffwechselaktivität um 56, 56 bzw. 57 %. Unsere Studie bewertete nicht die Ausrottung, sondern bewertete die Fähigkeit der BRP-Proben, die Biofilmbildung zu hemmen. Laut Wei et al.40 ist die Hemmung der Biofilmbildung viel wichtiger als ihre Beseitigung, da die Hemmung der Biofilmbildung das Bakterienwachstum und damit die Bakterienreifung verhindert. Die hier präsentierten Ergebnisse zeigten, dass die BRP-Proben die Bildung von Multispezies-Biofilmen durch parodontale Bakterien um mindestens 50 % hemmten. Oblongifolin B ergab den niedrigsten MICB50-Wert (1,56 μg/ml) gegenüber dem von den ATCC-Stämmen gebildeten Multispezies-Biofilm. Für den von den klinischen Isolaten gebildeten Multispezies-Biofilm betrug der niedrigste MICB50-Wert 6,25 μg/ml. Diese Ergebnisse legen nahe, dass die isolierten Verbindungen Oblongifolin B und Guttiferon E alle lebensfähigen Zellen der meisten Monospezies- und Multispezies-Biofilme hemmten, die von den in dieser Studie untersuchten Bakterien gebildet wurden. Darin wurde darauf hingewiesen, dass die BRP-Proben die Bildung von Biofilmen hemmen und die Zellen innerhalb dieser Bakteriengemeinschaft erreichen können, wodurch sie eliminiert werden und nur das Glykoprotein-Konjugat ohne lebende Zellen zurückbleibt13.

Es ist erwähnenswert, dass die in dieser Arbeit gefundenen MICB50-Werte relativ niedrig sind, insbesondere für klinische Isolate, die im Allgemeinen resistenter sind und höhere Konzentrationen erfordern. Bei der niedrigsten Konzentration, die die Biofilmbildung um mindestens 50 % hemmen kann, dem sogenannten MICB50, konnten wir jedoch eine Hemmung des Biofilms um mindestens 50 % nachweisen. Mit anderen Worten: Dies entsprach nicht einer vollständigen Hemmung des Biofilms, was wahrscheinlich eine höhere Konzentration erfordern würde.

Es wurde bereits nachgewiesen, dass bioaktive Bestandteile von Propolis wie Flavonoide, Ester, Alkohole, ätherische Öle und andere organische Verbindungen eine antivirale Wirkung gegen Viren wie Herpesviren (HSV-1 und HSV-2), Sindbisviren, Parainfluenzaviren, Zytomegalieviren, HIV und Varicella Zoster (HSV-1 und HSV-2), Sindbis-Virus, Parainfluenzavirus, Cytomegalovirus, HIV und Varicella Zoster41,42. Zusätzlich zu den in dieser Studie nachgewiesenen antibakteriellen und antibiofilmischen Aktivitäten von BRP haben wir die Anti-CHIKV-Aktivität des rohen hydroalkoholischen Extrakts, der Fraktionen und der reinen Substanzen von BRP bewertet. Wir haben die Lebensfähigkeit der BHK-21-Zellen in Gegenwart der BRP-Proben mithilfe des MTT-Assays bewertet. In der Arzneimittelforschung gelten Proben als ungiftig, wenn die Zelllebensfähigkeitsrate über 50 % liegt, als mäßig zytotoxisch, wenn die Zelllebensfähigkeitsrate zwischen 25 und 50 % schwankt, und als hoch zytotoxisch, wenn die Zelllebensfähigkeitsrate weniger als 25 % beträgt43. In dieser Studie zeigten alle ausgewerteten Proben eine Zelllebensfähigkeit von mindestens 80 % bei einer Konzentration von 50 μg/ml für den Rohextrakt und die Fraktionen und 3 μg/ml für isolierte Verbindungen (Tabellen 3 und 4). Alle in dieser Studie ausgewerteten BRP-Proben ergaben eine Lebensfähigkeit der BHK-21-Zellen von mindestens 80 % (Tabellen 3 und 4), was höher war als die von Rufatto et al. gefundene Lebensfähigkeit der Zellen. 20, (zwischen 14,5 und 46 %).

In Bezug auf die Infektionstests lieferten die isolierten Verbindungen Neovestitol und Vestitol die vielversprechendsten Ergebnisse mit einer Virusinfektionshemmungsrate von 94 bzw. 97 % (Abb. 7). Obwohl mehrere natürliche Verbindungen mit antiviraler Aktivität, einschließlich Anti-CHIKV-Aktivität, beschrieben wurden, wurde das antivirale Potenzial von Neovestitol und Vestitol nicht untersucht. Unsere Ergebnisse zeigten höhere Hemmungsraten als die in anderen Studien mit natürlichen Molekülen berichteten, wie z. B. der Studie von Pohjala et al.44, die beim Screening von 356 Verbindungen, davon 123 natürliche Verbindungen, eine Infektionshemmungsgrenze von höchstens 75 % erreichten . Nach unserem besten Wissen gibt es keine Berichte über die Anti-CHIKV-Aktivität von BRP oder isolierten Verbindungen. Dies zeigt, wie wichtig es ist, das BRP-Potenzial als Kandidat für eine antivirale Behandlung zu nutzen. Unsere Studie leistete Pionierarbeit bei der Bewertung der BRP-Anti-CHIKV-Aktivität und erzielte starke Hemmungsraten, was den Weg für die Entwicklung antiviraler Medikamente gegen CHIKV und andere Viren ebnete.

Damit BRP sicher anwendbar ist, muss seine Toxizität in verschiedenen experimentellen Modellen bewertet werden. Das Mausmodell ist das am häufigsten verwendete In-vivo-Modell zur Bewertung der Toxizität von Behandlungen, weist jedoch Nachteile auf, wie unter anderem hohe Kosten, schwierige Wartung und Verzögerungen bei der Erzielung von Ergebnissen45. Daher haben wir hier die Toxizität anhand eines anderen In-vivo-Modells bewertet, des Nematoden C. elegans, eines vollständigen Tieres mit Verdauungs-, Fortpflanzungs-, endokrinen und neuromuskulären Systemen. C. elegans ist nicht nur klein, hat einen kurzen Lebenszyklus und ist leicht zu pflegen, sondern weist auch eine genetische Homologie von 60–80 % mit Menschen auf46. In diesem Zusammenhang haben wir die vielversprechendsten BRP-Proben auf ihre Toxizität gegenüber C. elegans untersucht. Die niedrigste Konzentration, die mindestens 50 % der Larven abtöten konnte (LC50), betrug 1500 μg/ml für den rohen hydroalkoholischen BRP-Extrakt und Oblongifolin B und 750 μg/ml für Gutiferon E. Diese Werte waren deutlich höher als alle MIC- und MICB50-Werte Konzentrationen, die in dieser Studie angegeben wurden.

Darüber hinaus wurde unterhalb dieser Konzentration, selbst nachdem die Larven zwei Tage lang BRP-Proben ausgesetzt waren, LC50 nicht erreicht, was das ungiftige Profil dieser Naturstoffe zeigt. Interessanterweise waren die LC50-Werte der in dieser Studie erhaltenen BRP-Proben gegen C. elegans höher als die LC50-Werte anderer brasilianischer Propolisarten, die gegen C. elegans untersucht wurden. Beispielsweise berichteten Campos und Mitarbeiter (2015)47, dass Propolisproben einen LC50-Wert von 461,8 μg/ml aufwiesen. Dabei lagen die als toxisch ermittelten BRP-Konzentrationen hoch, oberhalb des höchsten MHK-Wertes (400 µg/ml). Daher ist Propolis in den in dieser Studie verwendeten Konzentrationen nicht toxisch und kann bei Konzentrationen unter 1500 und 750 μg/ml sicher eingesetzt werden. Die hier erzielten Ergebnisse sind äußerst relevant, da durch verschiedene Methoden die antibakterielle Aktivität von brasilianischem rotem Propolis gegen eine Reihe parodontopathogener Bakterien nachgewiesen werden konnte. Ein weiterer hervorzuhebender Punkt ist die Anti-CHIKV-Aktivität der BRP-isolierten Verbindungen. Chikungunya-Infektionen haben eine hohe Inzidenz und Schwere, daher ist die Suche nach neuen Behandlungsmöglichkeiten äußerst wünschenswert. Unsere Ergebnisse stellen einen ersten Schritt für weitere Studien zu BRP als alternativem Ansatz zur Behandlung verschiedener Infektionskrankheiten dar.

Das in dieser Studie verwendete brasilianische rote Propolis hat eine antibakterielle Wirkung gegen eine Reihe parodontopathogener Bakterien. Darüber hinaus hemmen sein Rohextrakt und die isolierten Verbindungen Oblongifolin B und Guttiferon E in Konzentrationen, die den MHK-Konzentrationen ähneln oder leicht darüber liegen, Monospezies- und Multispezies-Biofilme um über 50 %. Medicarpin, Neovestitol und Vestitol hemmen die CHIKV-Infektion in vitro stark. Darüber hinaus haben Toxizitätstests an C. elegans gezeigt, dass der Rohextrakt, Oblongifolin B und Guttiferon E ungiftig sind, was sich als sicher und vielversprechend erwiesen hat, so dass diese Propolisproben in Zukunft als Arzneimittel verwendet werden können.

BRP wurde im März 2019 im brasilianischen Bundesstaat Canavieiras Bahia von der Canavieiras Beekeepers Association (COAPER) gesammelt. BRP wurde eingefroren und mit 70 %iger hydroalkoholischer Ethanollösung extrahiert, wie von Santiago et al.48 beschrieben. Der rohe wässrig-alkoholische Extrakt von BRP wurde mit organischen Lösungsmitteln (Hexan, Dichlormethan, Ethylacetat und n-Butanol) verteilt. Authentische Standards von BRP (7-O-Methylvestitol, Medicarpin, Vestitol, Neovestitol, Oblongifolin B und Guttiferon E), die zuvor von unserer Forschungsgruppe isoliert wurden, wurden zur Charakterisierung der Proben verwendet17.

Die chromatographische Analyse des BRP-Extrakts und seiner Fraktionen wurde auf einem Waters 2695 HPLC-Instrument durchgeführt, das an einen 2998-Photodiodenarray-Detektor (PDA) gekoppelt war, mit Empower 3-Software als Controller. Chromatografische Profile wurden auf einer Supelco Ascentis Express C-18-Säule (150 × 4,6 mm, 2,7 µm) durchgeführt. Die mobile Phase mit Wasser (A) (0,1 % Ameisensäure) und Acetonitril (B) wurde wie folgt verwendet: 10 → 100 % B bis 80 min; 100 % von B in 89 Minuten; 100 → 10 % in 90 Minuten, wobei der Zustand bis 95 Minuten beibehalten wird. Die Injektionen wurden mit einer Flussrate von 1 ml/min, einer Temperatur von 40 °C und einem Injektionsvolumen von 10 µL durchgeführt. Chromatogramme wurden bei 275 nm aufgenommen.

Für die antibakteriellen, antiviralen und Toxizitätstests wurden der rohe hydroalkoholische Extrakt von BRP, Fraktionen in Dichlormethan, Hexan, Ethylacetat, n-Butanol sowie die isolierten Verbindungen Guttiferon E, Oblongifolin B, Methylvestitol, Medicarpin, Vestitol usw. verwendet Neovestitol.

Die in den antibakteriellen und Antibiofilm-Aktivitätstests verwendeten parodontopathogenen Bakterienstämme wurden von der American Type Culture Collection (ATCC) bezogen; Ihre jeweiligen klinischen Isolate wurden aus parodontalen Infektionen beim Menschen gewonnen. Zu den Stämmen gehörten Porphyromonas gingivalis (ATCC 49417 und klinisches Isolat), Fusobacterium nucleatum (ATCC 10953 und klinisches Isolat), Prevotella intermedia (ATCC 15033 und klinisches Isolat) und Actinomyces naeslundii (ATCC 19039 und klinisches Isolat). Diese Bakterien sind Teil der Sammlung des Antimicrobial Assays Laboratory (LEA, Abkürzung auf Portugiesisch) der Bundesuniversität Uberlândia (UFU) und wurden bei –20 °C kryokonserviert. Für die In-vivo-Toxizitätstests wurde der Mutantenstamm Caenorhabditis elegans AU37 verwendet, der vom Genetics Center (CGC, University of Minnesota) bezogen wurde.

Für die antiviralen Tests wurde ein CHIKV gerettet, das den Nanoluciferase-Reporter (CHIKV-nanoluc) basierend auf dem CHIKV-Stamm LR2006PYY1 (Genotyp Ost-/Zentral-/Südafrika) exprimiert49. Die Protokolle wurden wie zuvor beschrieben durchgeführt50.

Die antibakterielle Aktivität des rohen hydroalkoholischen BRP-Extrakts, der Fraktionen und der isolierten Verbindungen wurde mit der Bouillon-Mikroverdünnungsmethode in dreifacher Ausfertigung bewertet. Die Tests wurden in 96-Well-Mikrotiterplatten durchgeführt; Es wurde die vom Clinical and Laboratory Standards Institute52 empfohlene Methodik mit Änderungen befolgt. Das Inokulum wurde auf die McFarland-0,5-Skala standardisiert und auf eine Bakterienkonzentration von 1,5 × 106 KBE/ml in den Vertiefungen verdünnt. Zur Vorbereitung der Proben wurden der rohe hydroalkoholische Extrakt, die Fraktionen oder die isolierten BRP-Verbindungen in 5 % Dimethylsulfoxid (DMSO) gelöst und in Brucella-Brühe, ergänzt mit Hämin (5,0 mg/ml) und Menadion (1,0 mg/ml), verdünnt. Es wurde eine zweifache Reihenverdünnung mit Konzentrationen im Bereich von 0,195 bis 400 µg/ml verwendet. Es wurde eine Kontrolle mit 5 % DMSO durchgeführt und das Lösungsmittel beeinträchtigte das Bakterienwachstum bei dieser Konzentration nicht. Außerdem wurden folgende Kontrollen durchgeführt: Inokulum (alle im Test verwendeten Bakterien + Kulturmedium), um die Lebensfähigkeit der Bakterien zu beobachten; Brühe, um sicherzustellen, dass das Kulturmedium steril ist; und BRP-Probe, um sicherzustellen, dass diese Lösung steril ist. Die Mikrotiterplatten wurden in einer anaeroben Kammer (Don WhitleyScientific, Bradford, UK) unter anaeroben Bedingungen (80 % N2, 10 % CO2 und 10 % H2) 72 Stunden lang bei 37 °C inkubiert. Rezasurin wurde verwendet, um Bakterienwachstum aufzudecken – die blaue Farbe zeigte an, dass kein Bakterienwachstum stattfand, und die rosa Farbe zeigte das Vorhandensein von Bakterien an53. Als Kontrolltechnik wurde Metronidazol in einer Konzentration von 0,0115 bis 5,9 μg/ml gegen die Kontrollbakterien Bacteroides fragilis (ATCC 25285) und Bacteroides thetaiotaomicron (ATCC 29741)52 eingesetzt.

Zur Beurteilung der Antibiofilm-Aktivität wurden die BRP-Proben, die die vielversprechendsten MHK-Ergebnisse gegen vier oder mehr Bakterien aufwiesen, dem MICB50-Test (Minimum Inhibitory Concentration of Biofilm) unterzogen. MICB50 ist definiert als die niedrigste Konzentration des mikrobiellen Wirkstoffs, die die Biofilmbildung um mindestens 50 %40 hemmen kann, und wird anhand der folgenden Gleichung berechnet:

Hier wurde MICB50 wie in den CLSI-Richtlinien (2007)52 beschrieben, mit Modifikationen, bestimmt. Zunächst wurde die Fähigkeit der analysierten Stämme überprüft, im sessilen Modus zu wachsen. Alle Stämme bildeten bei 1,5 × 106 KBE/ml nach 72-stündiger Inkubation bei 37 °C Monospezies- und Multispezies-Biofilme (Daten nicht gezeigt).

Für die Monospezies-Biofilme wurden 100 μl jedes Bakterieninokulums mit 1,5 × 106 KBE/ml in die Vertiefung gegeben, zusammen mit den zu bewertenden Propolisproben in Konzentrationen von 0,195 bis 400 μg/ml (hydroalkoholischer Rohextrakt, Oblongifolin B und Guttiferon E). . Die Mikrotiterplatten wurden 72 Stunden lang in einer anaeroben Kammer bei 37 °C inkubiert. Für die Multispezies-Biofilme wurden die wichtigsten parodontopathogenen Bakterien im oralen Biofilm ausgewählt und in zwei Gruppen eingeteilt: Gruppe 1 bestand nur aus den Standardbakterien (P. gingivalis ATCC 49417, P. intermedia ATCC 15033 und A. naeslundii ATCC 19039). , während Gruppe 2 nur aus den klinischen Isolaten P. gingivalis, P. intermedia und F. nucleatum bestand. Die Antibiofilmaktivität der vielversprechendsten BRP-Proben wurde im Vergleich zum Multispezies-Biofilm, der von Bakterien der Gruppe 1 gebildet wird, und im Vergleich zum Multispezies-Biofilm, der von Bakterien der Gruppe 2 gebildet wird, bewertet. Zu diesem Zweck wurden 33,33 μl jedes bewerteten Bakteriums, insgesamt 100 μl bakterielles Inokulum, mit 1,5 × 106 KBE/ml in die Vertiefungen gegeben, wobei die Propolisproben in Konzentrationen von 0,195 bis 400 μg/ml (roher hydroalkoholischer Extrakt) bewertet wurden , Oblongifolin B und Guttiferon E). Die Mikroplatten wurden unter den gleichen Bedingungen wie die Monospezies-Biofilm-Mikroplatten inkubiert. Als Kontrolle wurde das Standardantibiotikum Metronidazol in Konzentrationen von 0,0115 bis 5,9 μg/ml mit einer MHK50 verwendet (siehe ergänzendes Material, Abbildungen S2 und S3). Es wurde eine Kontrolle mit 5 % DMSO durchgeführt und das Lösungsmittel beeinträchtigte das Bakterienwachstum bei dieser Konzentration nicht. Außerdem wurden folgende Kontrollen durchgeführt: Inokulum (alle im Test verwendeten Bakterien + Kulturmedium), um die Lebensfähigkeit der Bakterien zu beobachten; Brühe, um sicherzustellen, dass das Kulturmedium steril ist; und BRP-Probe, um sicherzustellen, dass diese Lösung steril ist. Nach der Inkubation wurde die überstehende Kultur entnommen und die Planktonzellen durch Waschen der Vertiefungen mit hochreinem destilliertem Wasser entfernt. Monospezies- und Multispezies-Biofilme wurden mit Methanol fixiert und mit 2 % Kristallviolett angefärbt54. Die Ablesung erfolgte in einem Mikroplatten-Lesegerät (GloMax®) bei 595 nm. Die Ablesung erfolgte in einem Mikroplatten-Lesegerät (GloMax®) bei 595 nm. Die Experimente wurden in dreifacher Ausführung und unabhängig voneinander durchgeführt.

Dieser Assay wurde für Monospezies- und Multispezies-Biofilme gemäß de Souza Silva et al.39 durchgeführt, wie unten beschrieben. Zwei Mikrotiterplatten wurden inkubiert, eine zur MICB50-Bestimmung und die andere zur Mikroorganismenzählung. Nach der Inkubation der Mikroorganismenzählungs-Mikrotiterplatte wurde der Überstand entnommen und die Planktonzellen durch Waschen der Vertiefungen mit hochreinem destilliertem Wasser entfernt. Anschließend wurde in alle Vertiefungen der Mikrotiterplatte ergänzte Brucella-Brühe gegeben und der Biofilm nach einem Ultraschallbad von der Vertiefung abgelöst. Dann wurden in jeder Vertiefung einer Mikrotiterplatte mit 96 Vertiefungen zehnfache Reihenverdünnungen durchgeführt, und 50 μl jeder Vertiefung, entsprechend jeder hergestellten Verdünnung, wurden auf zwei Platten mit Brucella-Agar, ergänzt mit Pferdeblut (5 %), Hämin (5,0 mg), gegeben /ml) und Menadion (1,0 mg/ml). Jede der Platten wurde wie von Harrison et al.55 beschrieben in acht Teile fraktioniert und in einer anaeroben Kammer bei 37 °C inkubiert. Nach 72 Stunden wurde die Zählung der koloniebildenden Einheiten (CFU) in jeder Platte durchgeführt. Die Ergebnisse wurden als Log10 (KBE/ml) ausgedrückt und die Tests wurden unabhängig voneinander in dreifacher Ausfertigung durchgeführt.

Die BHK-21-Zellen (Fibroblasten aus der Niere des syrischen Goldhamsters; ATCC CCL-10) wurden in Dulbeccos modifiziertem Eagle-Medium (DMEM, Sigma-Aldrich), ergänzt mit 100 U/ml Penicillin (Hyclone Laboratories), 100 mg/ml Streptomycin, gehalten (Hyclone Laboratories), 1 % Verdünnung der Stammlösung nicht-essentieller Aminosäuren (Hyclone Laboratories) und 1 % fötales Rinderserum (FBS, Hyclonen Laboratoires) in einem befeuchteten 5 % CO2-Inkubator bei 37 °C.

Die Lebensfähigkeit von BHK-21-Zellen in Gegenwart der getesteten BRP-Proben wurde mit dem MTT-Assay [3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazoliumbromid] (Sigma-Aldrich) gemessen. BHK-21-Zellen wurden in Mikrotiterplatten mit 48 Vertiefungen kultiviert und 16 Stunden lang bei 37 °C mit unterschiedlichen Konzentrationen der getesteten BRP-Probe behandelt. Anschließend wurde das Medium, das die getestete BRP-Probe enthielt, aus der 48-Well-Mikroplatte entfernt. Als nächstes wurde 1 mg/ml MTT-Lösung in jede Vertiefung gegeben, 30 Minuten lang inkubiert und durch 300 μl DMSO ersetzt, um die Formazankristalle zu solubilisieren. Die Absorption wurde bei 490 nm auf einem Glomax-Mikroplattenlesegerät (Promega) gemessen. Die Lebensfähigkeit der Zellen wurde gemäß der Gleichung (T/C) × 100 % berechnet, wobei T und C die optische Dichte der behandelten Vertiefung bzw. der Kontrollgruppe darstellen. DMSO wurde als unbehandelte Kontrolle verwendet50.

Für ein erstes Screening der Anti-CHIKV-Aktivität des rohen hydroalkoholischen BRP-Extrakts und der isolierten Verbindungen wurden HK-21-Zellen 24 Stunden vor der Infektion mit einer Dichte von 5 × 104 Zellen pro Vertiefung in Mikrotiterplatten mit 48 Vertiefungen ausgesät. CHIKV-nanoluc mit einer Infektionsmultiplizität56 von 0,1 und die getestete isolierte Verbindung oder der getestete Extrakt wurden gleichzeitig zu den Zellen gegeben. Die Zellen wurden 16 Stunden nach der Infektion (hpi) in Renilla-Luciferase-Lysepuffer (Promega) geerntet und die Virusreplikation wurde durch Messung der Nanoluciferase-Aktivität mit dem Renilla-Luciferase-Assay-System (Promega) quantifiziert. Die CHIKV-Replikationsraten wurden gemäß der Gleichung (T/C) × 100 % berechnet, wobei T und C die optische Dichte der behandelten Vertiefung bzw. der Kontrollgruppe darstellen. Als unbehandelte Kontrolle wurde DMSO 0,1 % verwendet.

Die Toxizitätsbewertung wurde für die vielversprechendsten BRP-Proben im CIM unter Verwendung des In-vivo-Modells von C. elegans gemäß Andrade et al.57 und Singulani et al.58 durchgeführt. Der Mutantenstamm C. elegans AU37 wurde in mit Escherichia coli OP50 beimpften Nematode Growth Medium (NGM)-Platten kultiviert und 72 Stunden lang bei 16 °C inkubiert. Nach der Inkubation wurden die NGM-Platten mit Larven und Eiern mit M9-Puffer gewaschen und der Überstand in konische 15-ml-Röhrchen gegeben. Außerdem wurde eine Bleichlösung (Hypochlorit + NaOH) zugesetzt, um die erwachsenen Larven abzutöten. Die Eier wurden in NGM-Platten gelegt und erneut 24 Stunden lang bei 15 °C inkubiert. Später wurden die NGM-Platten mit den Larven im L1/L2-Stadium mit M9-Puffer gewaschen und der Überstand auf mit E. coli OP50 beimpfte NGM-Platten übertragen und 24 Stunden bei 16 °C inkubiert. Nach der Synchronisierung wurden 20 µL des NGM-Platteninhalts, der 10 bis 20 Larven im L4-Stadium enthielt, in jede Vertiefung einer 96-Well-Mikrotiterplatte mit flachem Boden gegeben und 72 Stunden lang bei 16 °C inkubiert. Der hydroalkoholische Rohextrakt von BRP wurde mit 750 bis 6000 μg/ml bewertet, und die isolierten Verbindungen Oblongifolin B und Guttiferon E wurden mit 5,85 bis 1500 μg/ml bewertet. Als Lösungsmittel wurde DMSO verwendet (Endkonzentration ≤ 1 %).

Die Larven wurden an drei aufeinanderfolgenden Tagen alle 24 Stunden unter einem Umkehrmikroskop gezählt. Larven, die sich bewegten, galten als lebendig und statisch, auch wenn sie berührt wurden, galten sie als tot. Für jede Probe wurde die niedrigste Konzentration, die in der Lage war, 50 % der Larven abzutöten, die sogenannte Lethal Concentration (LC50), nach Zeit bestimmt.

Einzelne Experimente wurden dreifach durchgeführt und alle Tests wurden mindestens dreimal durchgeführt, um die Reproduzierbarkeit der Ergebnisse zu bestätigen. Unterschiede zwischen den Mittelwerten der Messwerte wurden durch Varianzanalyse (einfaktorielle oder zweifaktorielle ANOVA) oder Student-t-Test verglichen, der mit der Software Graph Pad Prism 8.0 (Graph Pad Software) durchgeführt wurde. Die p-Werte ≤ 0,05 wurden als statistisch signifikant angesehen.

Alle während dieser Studie generierten oder analysierten Daten sind in diesem veröffentlichten Artikel (und seinen ergänzenden Informationsdateien) enthalten.

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Diese Arbeit wurde finanziert von der Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP Grant # 2017/04138–8), der Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de Minas Gerais (FAPEMIG # 12138 – Stipendium gewährt; APQ-03385–18 und APQ-01487–22), Coordination for the Improvement of Higher Education Personnel (CAPES Finance Code 001 – Stipendium gewährt und Prävention und Bekämpfung von Ausbrüchen, Endemiten, Epidemien und Pandemien – Finance Code #88881.506794/2020–01) und National Development Council Scientific und technologisch (CNPq Grant # 307974/2019–7).

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Regina Helena Pires

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Korrespondenz mit Carlos Henrique Gomes Martins.

Die Autoren geben an, dass keine Interessenkonflikte bestehen.

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Nachdrucke und Genehmigungen

Silva, NBS, de Souza, JH, Santiago, MB et al. Mögliche antiparodontopathogene In-vitro- und Anti-Chikungunya-Aktivitäten und In-vivo-Toxizität von brasilianischem rotem Propolis. Sci Rep 12, 21165 (2022). https://doi.org/10.1038/s41598-022-24776-4

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Eingegangen: 22. August 2022

Angenommen: 21. November 2022

Veröffentlicht: 07. Dezember 2022

DOI: https://doi.org/10.1038/s41598-022-24776-4

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